急性白血病细胞中TSC2异常表达对mTORC1通路活性及白血病细胞生物学的影响

Recent studies have demonstrated that the mTORC1 pathway is aberrantly activated in blasts from acute leukemia (AL) patient and that mTOR inhibitors strongly inhibits the growth of the most immature AL cell lines. mTORC1 activation is regulated by different upstream mechanisms, mostly convergent on the TSC1/TSC2 complex. These include PI3K/AKT, which can activate mTORC1 by phosphorylating TSC2. Several studies have indicated that constitutive mTORC1 activation is PI3K-independent in AL and the mechanisms leading to constitutive mTORC1 activation in primary AL blast cells are currently unknown. Our previous study demonstrated that the reduced expression of TSC2 might be involved in the pathogenesis of leukemogenesis and hypermethylation of the TSC2 promoters are associated with the reduced expression. These data raise the question as to whether TSC2 genes deficiencies are related to the constitutively activation of mTOR and dysfunction of TSC2-mTORC1 pathway is involved in AL. This study will detect the expression of TSC2 in AL blast cells in control of normal bone marrow CD34 positive cells through real time PCR and western bolt to further validate the downregulation of TSC2 in AL；investigate the effect of mTOR kinase activity and leukemia cell biology for TSC2 via small interfering RNAs technology; explore the treatment of AL with TSC2 overexpression and mTOR inhibitors or demethylating agent. This will provide a new AL pathogenesis based on TSC2-mTORC1 pathway and provoked a new promising therapeutic strategy for AL.

mTORC1信号通路在急性白血病（AL）细胞中常常被过度激活，其活化过程通过不同的上游信号机制调节，但最终聚焦于TSC1/TSC2复合体，其中，PI3K/AKT能够通过磷酸化抑制TSC2进而激活mTORC1。但是，在部分AL细胞中，mTORC1的活化是PI3K/AKT非依赖性的，其活化机制还不清楚。我们前期研究发现，TSC2基因在部分AL患者中表达降低，其启动子区的超甲基化是其表达下调的原因。由此提出假设：在AL细胞中，TSC2低表达与mTORC1的异常激活及白血病的发生有关。本项目将针对AL骨髓原始细胞并以正常人骨髓CD34阳性细胞为对照，联合siRNA技术，研究TSC2低表达对mTORC1通路激酶活性及白血病细胞生物学的影响；通过慢病毒表达系统研究过表达TSC2联合mTORC1抑制剂或去甲基化药物对AL的治疗作用，为进一步探索AL发病机制、开发个体化靶向治疗药物提供理论基础。

研究背景：mTORC1信号通路在急性白血病（AL）细胞中常常被过度激活，其活化过程通过不同的上游信号机制调节，但最终聚焦于TSC1/TSC2复合体，其中，PI3K/AKT能够通过磷酸化抑制TSC2进而激活mTORC1。但是，在部分AL细胞中，mTORC1的活化是PI3K/AKT非依赖性的，其活化机制还不清楚。我们前期研究发现，TSC2基因在部分AL患者中表达降低，其启动子区的超甲基化是其表达下调的原因。由此提出假设：在AL细胞中，TSC2低表达与mTORC1的异常激活及白血病的发生有关。.研究内容：本项目选择TSC2低表达的U937细胞，通过慢病毒介导的RNA干扰技术下调TSC2基因的表达，检测TSC2基因低表达对细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡的影响，同时采用蛋白印记技术检测TSC2基因低表达对mTOR激酶活性的影响，对mTOR通路蛋白激酶活性的影响以及对其下游靶基因表达的影响。观察mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin, RAPA）联合DNA甲基化酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine, 5-Aza-dC）对TSC2表达降低的U937细胞在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化方面的作用。针对甲基化导致的TSC2表达降低和mTOR活性升高，我们观察了mTOR抑制剂雷帕霉素和去甲基化药物5-氮杂分别及联合处理对TSC2表达降低的Nalm6细胞的生物学作用。.研究结果：TSC2基因表达降低能够促进U937细胞的细胞增殖和克隆形成能力，对细胞分化和细胞凋亡没有明显影响；TSC2基因表达下调后，mTOR活性升高，磷酸化的4EBP1和S6K1蛋白活性升高，与细胞增殖相关的基因PTEN、cyclinD1、P27KIP和c-myc表达升高，而AKT蛋白活性和凋亡相关基因BCL-XL的表达没有明显的改变。mTOR抑制剂雷帕霉素和去甲基化药物5-氮杂联合用药对TSC2低表达的U937细胞具有更强的抑制作用。mTOR抑制剂雷帕霉素和去甲基化药物5-氮杂联合作用对Nalm6细胞具有更强的抑制作用。.科学意义：本项目明确TSC2基因表达下调可以导致mTOR活性升高，而针对TSC2基因表达下调的原因--启动子的超甲基化，联合mTOR抑制剂和去甲基化药物具有更好的抗白血病细胞作用，为急性白血病的靶向治疗提供了进一步的理论基础。