中药砒霜的活性代谢产物对急性早幼粒细胞性白血病NB4细胞分化及PML-RARα融合蛋白SUMO化影响研究

In traditional chinese medicine, arsenic trioxide (As2O3) is being widely used in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL), because it has been demonstrated that As2O3 is able to bound to PML-RARα fusion proteins, which resulted in initiating PML/RARα oncoprotein degradation, promoting its APL cells differentiation and clinical remission of APL patients. On the other hand, As2O3 can be transformed metabolically into most toxic methylated metabolites such as trivalent monomethylarsonous acid (MMAIII) and dimethylarsinous acid (DMAIII) in the body, and the final metabolites that are excreted in the urine are mostly mono- and dimethylated pentavalent species. However, it is unknown regarding he anticancer effect of its active intermediate metabolites (i.e., MMAIII and DMAIII) in clinical remission of APL pateints. Thereby, the mechanism underlying the effects of arsenic compound should be clearly identified. In the present study, we used human APL cell line NB4 cells, and focused on the effects of As2O3 and its intermediates (i.e., MMAIII and DMAIII) on cell survival, induction of apoptosis and differentiation as well as degradation of PML-RARa fusion proteins. In our preliminary experiment, we found the intermediate metabolites have strong effects on the induction of apoptosis, and mechanism of intermediates action is unlikely to be similar to that of precursors, As2O3. Moreover, only As2O3 but not other two species induce the attachment of the ubiquitin-like SUMO-1 molecule to the PML moiety of PML-RARa. From above observations, we propose that the methylated MMAIII and DMAIII may have a beneficial therapeutic effect (e.g., induction of apoptosis) on APL patients.

砒霜为中药砒石升华所得精制品，在临床上用于治疗急性早幼粒细胞白血病的效果已被国际认可。但目前对砒霜治疗白血病的机理研究，大多数研究者都集中在单一As2O3对细胞影响作用机理研究上，而忽略了砷在体内代谢过程中所产生的活性代谢产物对治疗的白血病的贡献及作用。研究发现砷在人体内在砷甲基转移酶催化下，可迅速代谢为不同形态的有机代谢产物，如活性极高的三价一甲基（MMAIII）和二甲基亚砷酸（DMAIII）等。因此，砒霜的中间代谢产物很可能发挥着更强的诱导白血病细胞分化或凋亡作用，或与As2O3有协同治疗作用。本实验采用流式细胞术、免疫印迹、免疫荧光共聚焦等技术重点研究砷的活性中间代谢产物对白血病细胞NB4的作用，探讨其机制，阐明砷的中间代谢产物对降解PML-RARa融合蛋白、诱导细胞分化以及凋亡等方面的异同点。通过上述实验，拟优化砷化合物在APL治疗上的效果，延长急性早幼粒细胞白血病患者的生存周期。

急性早幼粒细胞性白血病（APL）是临床上第一个利用诱导分化和针对肿瘤特异性标志分子（PML-RARα融合蛋白）进行治疗，并取得显著疗效的恶性肿瘤。中药砒霜（主要成分As2O3）是目前治疗急性早幼粒细胞白血病的有效药物之一，我国在砒霜治疗APL方面处于国际领先地位。研究发现砒霜主要作用于PML-RARa融合蛋白（即As2O3结合PML的RBCC结构域），可诱导PML蛋白多聚化，使PML从核质（Nucleoplasm）转移至核基质（Matrix）中形成PML-NBs，促进PML-NBs招募多种蛋白，继而发生SUMO化和泛素化，经蛋白酶体途径降解PML-RARa融合蛋白，最终达到治疗目的。但随着对砷代谢机理的深入研究，发现砒霜在人或动物体内在砷甲基转移酶的催化下，迅速代谢为不同形态的有机代谢产物例如活性极高的三价一甲基亚砷酸 (MMAIII) 和二甲基亚砷酸（DMAIII）等中间代谢产物。目前，关于砒霜及代谢产物MMAIII和DMAIII对白血病细胞作用机制方面的研究较少。因此，非常有必要阐明砒霜在代谢过程中所产生的中间活性代谢产物MMAIII和DMAIII对砷剂治疗APL患者中的贡献及作用机制。. 为了阐明As2O3、MMAIII和DMAIII的不同作用机理，我们利用NB4细胞（APL细胞）进行了研究。NB4细胞分别经砒霜及代谢产物MMAIII和DMAIII处理后发现，砒霜完全降解了PML-RARa融合蛋白，但是MMAIII和DMAIII不具备降解PML-RARa蛋白功能。另外，砒霜可诱导细胞核内弥散PML微小颗粒为较大的PML和核体（表明细胞已开始分化）。但是， MMAIII和DMAIII无效果（表明无分化作用）。但有趣的是，虽然砷甲基化代谢产物无诱导细胞分化功能，但是具有较强的诱导细胞凋亡作用。而且，一甲基砷代谢产物MMAIII主要通过线粒体途径诱导细胞凋亡，而二甲基代谢产物DMAIII则通过内质网应激途径诱导细胞凋亡。此项研究成果为中药砒霜及其活性代谢产物治疗APL机理提供了新的证据，详细阐明了As2O3及其活性代谢产物MMAIII及DMAIII在治疗APL过程中的贡献及作用机理，从而打破单一研究砒霜治疗白血病的局面，为多途径治疗白血病提供崭新的科学理论依据。相关成果发表在Oncotarget、Chem Res Toxicol、Metallomics等国际期刊。