无机砷代谢物治疗急性早幼粒细胞白血病机制的研究

Our research will focus on the mechanism of inorganic arsenic metabolites in the treatment of acute promyelocytic leukemia.The eukaryotic expression vector of human arsenic methyltransferas,pEGFP-N1-AS3MT, will be constructed and transfected into leukemia cells NB4 and HL-60 and the stable expression cell lines will be established. First, the effects of As2O3 and its metabolites on the apoptosis, differentiation and growth inhibition of NB4 and HL-60 reconstruction cells will be evaluated by fluorescence microscopy, confocal microscopy, flow cytometry and so on. Secondly, the impacts of As2O3 and its metabolites on the ROS production, the level of Bcl-2, the activation of Caspase-3, the activity of GPx and PML-RARa degradation in NB4 reconstruction cell and the interactions between apo-PML-R as a model of PML-RARa and As2O3 metabolites in vitro will be studied to explore the molecular mechanisms of As2O3 metabolites in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Last but not least ,exploring the influence of the reducing agent (DTT, GSH, and TCEP, etc.) and the antagonist Se on the metabolism of As2O3 in NB4 and HL-60 reconstruction cells, and cell morphology, toxicity and differential protein expression will provide useful information for the comprehensive in-depth study of the mechanism of arsenic in the treatment of leukemia, as well as clinical treatment of leukemia.

本项目主要围绕"无机砷代谢物治疗急性早幼粒细胞白血病机制的研究"开展如下工作：（1）构建人砷甲基化酶真核表达载体pEGFP-N1-AS3MT，转染白血病细胞NB4和HL-60，建立稳定表达的细胞系。（2） 利用荧光显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞仪等方法研究As2O3及其代谢产物对重组NB4和HL-60细胞系的诱导凋亡、分化和生长抑制作用以及对重组NB4细胞系中ROS、Bcl-2、Caspase-3、GPx活性以及PML-RARa降解等的影响；在体外研究As2O3的代谢产物与PML-RARα的相互作用，探讨As2O3的代谢产物治疗白血病的分子机制。（3）探讨还原剂（DTT、GSH和TCEP等）和拮抗剂Se等影响因素对As2O3在重组NB4和HL-60细胞系中代谢的影响以及对细胞形态、毒性和蛋白差异表达等的影响,为全面研究砷治疗白血病的机制及临床治疗白血病提供有益信息。

本项目围绕"无机砷代谢物治疗急性早幼粒细胞白血病机制的研究"进行了系统研究，取得了以下有新意的研究成果：(1) 建立了人砷甲基化酶稳定表达的细胞系，研究As2O3在细胞中的代谢；运用同源建模和定点突变技术、酶动力学及光谱学等实验方法系统研究并确定了hAS3MT 中SAM 结合位点和底物无机砷的结合位点，进一步推测了甲基转移的机理。(2) 以NB4细胞和原代APL细胞为研究对象，系统探究了As4S4和As3+联合对NB4细胞以及原代APL细胞凋亡和分化的影响以及分子机制。研究结果表明，与As4S4单独处理组以及As3+单独处理组相比，二者联合可以显著促进NB4细胞和原代APL细胞的分化和凋亡。这说明，As4S4和As3+联合可以显著提高药物治疗APL的效果。(3) 以NB4细胞和原代APL细胞为研究对象，系统探究了Se4+和As3+联合对NB4细胞以及原代APL细胞凋亡和分化的影响以及分子机制。As3+与Se4+联合可以显著诱导APL细胞的凋亡和分化，且Se4+的加入会降低因为As3+的甲基化代谢而引起的氧化损伤，As3+和Se4+联合用药提高了As3+药物疗效的同时降低药物的毒副作用。因此，As3+和Se4+联合确实是一种好的治疗APL的方法。进一步系统研究了Apo-PML-R与硒的结合位点以及硒诱导PML降解的机制，Se4+通过与PML-R-ZF1结合来诱导PML-R折叠形成稳定构象，继而引起PML和PML-RARα融合蛋白的降解。不同于As3+的是，Se4+并非是与PML-R结合的最终形态。Se4+首先被PML-R上的半胱氨酸残基还原为Se2+，之后Se2+才与蛋白上的两个半胱氨酸残基（Cys9和Cys12）结合。 (4) 以HepG2细胞为研究对象，探究了DMPS对As3+中毒的解毒机制。DMPS从三个方面来减轻由As3+引起的生物毒性： 1. DMPS抑制细胞对As3+的吸收并促进As3+及其代谢产物的排泄；2. DMPS可下调hAS3MT在细胞内的表达，并竞争性地抑制As3+甲基化反应；3. DMPS可以清除由As3+引起的ROS累积，继而降低As3+对机体的氧化损伤。该工作为全面研究砷治疗白血病的机制及临床治疗白血病提供有益信息。