玉米单倍体雄穗育性自然恢复基因精细定位、克隆及功能表达分析

DH (doubled haploid) breeding, which can significantly shorten the time period of lines improvement, speed up the breeding progress. But this technology development has always been limited by low haploid male fertility rate, which related with genetic factors. In present study, an BH (backcross haploid) population derived from maize inbred with different haploid male fertility rates Yu8701 (80%) and Zheng58 (5%) will be analysed and be used to make fine mapping and cloning of the gene for haploid male fertility in natural condition through map-based cloning method. The functional markers will be developed for the gene according to their allelic variants among different materials, and the differences between phenotype and genotype will be analyzed. The expressions of haploid male fertility gene during tassel development will be analyzed by quantitative real-time PCR and Western Blotting, and the transgenic function verification will be made by construction of appropriate vectors based on the differences of ORF sequences and expression quantity of the candidate gene between two parents. This study will provide useful functional markers for the improvement of high-throughput DH lines through marker-assisted selection in maize breeding, reveal the mechanisms of haploid male fertility, and ultimately provide the scientific basis for the molecular biology research on DH breeding in a large scale.

双单倍体（doubled haploid,DH）育种显著缩短选系时间，加快育种进程。但此项技术的推广受到低的单倍体雄穗育性自然恢复效率的限制，育性恢复能力与遗传因素相关。本研究拟通过分析玉米单倍体雄穗育性恢复率差异亲本豫8701（恢复率80%）和郑58（恢复率5%）组配的单倍体回交BH（backcross haploid）群体育性恢复情况，利用图位克隆的方法将控制单倍体雄穗育性恢复基因进行精细定位并克隆，根据高低频材料之间序列差异开发基因功能标记，并分析基因型和表型之间关系；利用实时荧光定量PCR和West Blotting技术分析单倍体雄穗不同发育时期基因表达模式；根据双亲在候选基因编码区序列差异情况及表达量差异构建合适载体进行转基因功能验证。研究结果将为分子标记辅助选择选育高通量DH系提供有效的功能标记，揭示单倍体雄穗育性恢复机理，最终为开展规模化DH育种的分子生物学研究提供科学依据。

双单倍体（doubled haploid,DH）育种显著缩短选系时间，加快育种进程。但此项技术的推广受到低的单倍体雄穗育性自然恢复效率的限制，育性恢复能力与遗传因素相关。本研究首先对26个骨干自交系的玉米单倍体雄穗育性恢复表型鉴定，利用筛选得到玉米单倍体雄穗育性恢复率差异亲本豫8701（恢复率80%）和郑58（恢复率5%）组配了单倍体回交BH（backcross haploid）群体。其次利用图位克隆的方法将控制单倍体雄穗育性恢复基因进行精细定位，利用低亲材料郑58不断回交加倍单倍体群体得到的不同世代的BH后代（群体量约为1万株），寻找交换单株结合设计的多态性SSR标记、In-Del标记和CAPS标记对6号染色体上的主效QTL位点qhmf4进行精细定位，最终将候选区段缩小在500kb 的范围之内。接着根据高低频材料之间序列差异开发基因功能标记IND166和IND1668，利用新开发的分子标记对200个骨干材料进行了筛选，将筛选得到的自交系通过组配获得审定品种一个。通过对此区间的候选基因进行生物信息学分析，认为控制第一次减数分裂缺失基因afd1是最可能的候选基因。通过对国外主要遗传材料进行筛选，得到高频单倍体雄穗育性恢复材料GF1和低频单倍体雄穗育性恢复材料GF3和GF5，对单倍体雄穗育性恢复进行遗传研究。通过组配GF1/GF3的F1单倍体分离群体，结合6K SNP芯片分子标记和SSR标记，利用偏分离定位的方法和复合区间作图法，在玉米第1、5和6号染色体上分别定位到三个与玉米单倍体雄穗育性恢复相关的QTL位点，其中位于5号染色体的qshgd1为另一个主效位点。取高低亲亲本单倍体幼穗，提取RNA后进行建库测序，根据RNA-seq分析结果发现，候选基因afd1在高亲材料8701中显著下调。利用农杆菌浸染玉米幼胚的方法进行转基因，获得了玉米转基因T0代植株和籽粒。研究结果可以为分子标记辅助选择选育高通量DH系提供有效的功能标记，揭示单倍体雄穗育性恢复机理，最终为开展规模化DH育种的分子生物学研究提供科学依据。