Msc-1 基因调控辣椒 GMS 育性的分子机理研究

Male sterility has an important application value in the utilization of pepper heterosis. Due to the widely sources of male parent in breeding which is beneficial to cultivate improved varieties, and the fertility of GMS is more stable, the application of GMS is much promising. Based on fine mapping and cloned the fertility gene (Msc-1) in GMS, we through the spatio-temporal expression, subcellular localization, VIGS and genetic transformation (Gene knockout technique and Pollen magnetofection) of pepper to definite the function of Msc-1. In the meantime we explore the Msc-1 gene regulatory network and screen upstream and downstream genes associated with Msc-1 by RNA-seq and Proteomics. And then verified the relationships of these genes with Msc-1 through protein-protein interactions, qRT-PCR and VIGS in order to explore the molecular mechanism of Msc-1 in regulating the GMS fertility in pepper. Taken together it can provide theoretical foundation for regulating the fertility and application value in the utilization of GMS in pepper.

雄性不育在辣椒杂种优势利用中有重要的应用价值。由于辣椒 GMS 利用时父本来源不受限制，有利于优良杂交品种的选育，且雄性不育较稳定，因此应用前景较为广阔。本项目在克隆到辣椒 GMS 育性控制基因 Msc-1 的基础上，进一步通过时空表达分析、亚细胞定位、VIGS 和遗传转化（基因敲除技术和纳米磁转化法等）辣椒等技术，明确 Msc-1 的功能；同时，结合转录组和蛋白组学分析探索 Msc-1 调控的基因网络，筛选与 Msc-1 有关的上下游候选基因和蛋白，通过蛋白互作技术、相关基因的表达分析和 VIGS 基因沉默技术等验证 Msc-1 与这些基因的互作关系。从而解析 Msc-1 调控辣椒 GMS 育性的分子机理。为辣椒育性调控和 GMS 在辣椒杂种优势中的利用提供理论依据。

辣椒杂种优势非常明显，雄性不育的利用可以显著地降低杂种种子生产成本，且易于保证杂种的纯度，因此开展辣椒雄性不育相关的研究一直备受关注，本项目通过对定位和克隆的辣椒细胞核雄性不育育性控制基因Msc-1进行了相关功能分析，主要研究结果如下：亚细胞定位结果表明Msc-1主要定位在细胞膜、细胞质和细胞核上；小孢子发育细胞学观察表明msc-1败育发生的关键时期是在四分体时期；通过对辣椒遗传转化品种、外植体、各个阶段激素配方进行筛选，目前初步建立了辣椒稳定的遗传转化体系，已获得一株Msc-1 CRISPR/Cas9敲除转基因植株，另有10株Msc-1 CRISPR/Cas9敲除转基因植株正在进行生根当中；Msc-1异位表达可以恢复番茄雄性不育材料ms-10的育性；对辣椒GMS（msc-1）不育株和可育株进行蛋白质组学和转录组学联合分析结果表明有13个差异表达蛋白﹑14个差异表达基因可能通过影响绒毡层的发育以及花粉外壁的合成，最终导致花粉败育；蛋白互作技术结果表明CaMsc-1与CabHLH91存在相互作用，VIGS沉默CabHLH91可以导致辣椒雄性不育，此外辣椒GMS（msc-1）不育株及其可育株转录组学分析结果中，差异基因显示CaMYB4和CaAMS1在不育株中下调，但CaMsc-2的表达不受影响，其次CabHLH91也不受CaMsc-1下调的影响。因此我们推测CaMsc-1可能与CabHLH91形成一个蛋白复合体来调控下游基因CaMYB4和CaAMS1的表达导致雄性不育。.通过本项目的研究，初步明确了Msc-1基因在辣椒GMS形成过程中的功能，探索了Msc-1基因调控辣椒GMS形成的分子机理，为人工调控辣椒育性、促进辣椒细胞核雄性不育在杂种优势当中的利用提供了一定的理论依据。