羟甲基化修饰DNA识别的结构机理研究

In higher eukaryotes, methylation of DNA on CpG sites plays important role in the regulation of gene expression. Mechanism studies on DNA methylation and demethylation are crucial for our understanding of cell differentiation and tumorgenesis. While the mechanism and the biological functions of DNA methylation are reasonably well understood, uncertainties about the demethylation need to be further investigated. Recent discovery of 5mC oxidation by Tet (Ten eleven translocation) proteins has elucidated a possible DNA demethylation pathway, as the Tet-catalyzed oxidation products may couple with base excision repair pathways, or via decarboxylases to achieve DNA demethylation. Among the three oxidized forms of 5mC, 5hmC is the most stable one and itself may participant in the regulation of gene expression. Compared to the relatively well understood of 5mC recognition, little is known about the preferential recognition of 5hmC. In this project, by structural biology approach, we aims to study the recognition mechanism of 5hmC by specific readers like the reported SRA domain of UHRF2 and other DNA endonucleases which specifically cut 5hmC-containing DNAs.

在高等真核生物中，DNA的胞嘧啶甲基化修饰在基因表达调控中发挥重要作用，研究DNA甲基化和去甲基化对于研究细胞分化、癌症发生等具有重要的意义。对于DNA的甲基化，目前人们已有较为深入的了解，而对于DNA的去甲基化则知之甚少。近几年的研究发现，TET可催化甲基化胞嘧啶的羟甲基化、醛基化和羧基化，进而通过碱基切除或脱羧基实现DNA的去甲基化。其中羟甲基化胞嘧啶（5hmC）是最稳定的中间产物，很多研究表明，5hmC本身也参与基因转录调节。因此，研究5hmC的识别机制具有重要的生物学意义。目前，虽然人们对5mC的识别机制已有一些研究结果，但对5hmC的识别机制还是未知的。本项目计划采用结构生物学研究手段，通过解析UHRF2与羟甲基化DNA复合物，以及某些特异识别5hmC的DNA限制性内切酶与羟甲基化DNA复合物的结构，并辅以必要的生物化学实验，研究5hmC的识别机制。

脊椎动物DNA上的甲基化胞嘧啶可被Tet蛋白氧化，进而实现DNA的去甲基化。羟甲基化胞嘧啶（5hmC）是该氧化过程的主要产物，并在胚胎发生、细胞分化和多种疾病的发生中发挥作用。目前对甲基化胞嘧啶的识别机制已有较多研究，但对5hmC的识别机制却知之甚少，因此本项目主要聚焦于对5hmC的识别机制研究。有研究发现UHRF2的SRA结构域特异识别5hmC，但其识别机制尚不清楚。本项目解析了UHRF2 SRA结构域与羟甲基化DNA的复合物晶体结构。结构中一个酪氨酸的芳香环侧链与翻转的5hmC嘧啶环形成堆叠，一个苯丙氨酸使结合口袋更适合结合5hmC，而5hmC羟基与UHRF2 SRA主链羰基形成的氢键在5hmC的特异性识别中发挥了关键作用。PvuRts1I是一种含有SRA-like结构域的5hmC特异性DNA内切酶，切割含有5hmC的双链DNA，因此本项目也将其作为研究5hmC特异识别的研究对象。本项目解析了PvuRts1I与羟甲基化DNA复合物晶体结构。PvuRts1I通过其SRA-like结构域识别5hmC，一个色氨酸芳香环侧链与翻转的5hmC嘧啶环形成堆叠，而另一个色氨酸侧链上的氨基与5hmC羟基形成氢键，在5hmC的特异识别中发挥关键作用。通过这两项工作，确认了SRA结构域是一种5hmC识别模块，阐明了SRA结构域识别5hmC的一般模式，并将有助于进一步理解UHRF2的生物学功能以及DNA羟甲基化修饰的一般规律。本项目的关注点为蛋白对DNA的特异识别，除了开展上述研究以外，本项目还研究了果蝇Zeste对DNA的特异识别机制。果蝇Zeste是一种重要的作用于染色质的基因表达调控蛋白，其生物学功能依赖于其DNA结合结构域对特定序列DNA的识别。本项目解析了Zeste DNA结合结构域与DNA的复合物晶体结构。Zeste的DNA结合结构域结构属于Myb/homeodomain-like折叠，含有经典的helix-turn-helix DNA结合基序，并包含Zeste特有的一段短螺旋和一段长loop。插入DNA大沟的α螺旋氨基酸侧链与碱基的直接相互作用决定了Zeste对DNA的序列特异性识别。这项工作揭示了homeodomain-like蛋白对DNA的一种新的识别模式，并将为阐明Zeste调控基因表达的复杂机制提供结构信息。