东亚飞蝗谷胱甘肽S-转移酶对马拉硫磷的代谢解毒机制研究

东亚飞蝗是世界性农业害虫，由于长期使用化学农药治理蝗灾，使得东亚飞蝗田间种群对马拉硫磷产生了不同程度的抗性。GST是昆虫三大解毒酶系之一，具有代谢多种农药的能力，也是东亚飞蝗对马拉硫磷抗性的成因之一。本项目拟以东亚飞蝗为研究对象，在RACE法调取GST家族基因全长的基础上，开展RNA干扰研究，配合马拉硫磷染毒，通过蝗虫死亡率筛选参与马拉硫磷代谢解毒的GST基因。对GST进行同源结构模拟、毒物分子对接实验，配合酶动力学、光谱学检测，筛选与GST结合的毒物分子。定点突变GST底物结合位点，与野生型相关指标比较，探讨GST对毒物分子的结合方式。利用昆虫表达系统表达GST，检验昆虫细胞内野生型GST的解毒能力以及定点突变对解毒效率的影响。最终阐释东亚飞蝗GST参与马拉硫磷的代谢解毒机制。研究结果对东亚飞蝗的合理施药、科学防治有重要意义；也将为新型杀虫剂的研发，实现蝗虫可持续控制提供科学依据。

飞蝗是世界性的农业害虫，在我国历史上记载的蝗灾90%以上都是由飞蝗引起的。由于长期使用化学农药治理蝗灾，使得飞蝗对马拉硫磷等化学农药产生了不同程度的抗性。谷胱甘肽硫转移酶昆虫三大解毒酶系之一，具有代谢多种农药的能力，也是飞蝗对马拉硫磷产生抗性的成因之一。..本课题通过搜索飞蝗转录组数据库，通过RACE-PCR先后克隆出32条飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因，包括28条细胞质谷胱甘肽硫转移酶和4条微粒体谷胱甘肽硫转移酶。系统发育分析表明，28条飞蝗细胞质谷胱甘肽硫转移酶分别属于sigma、epsilon、delta、theta、omega和zeta家族。根据飞蝗谷胱甘肽硫转移酶组织分布的特点，可将其分为广泛表达、部分表达和专一表达三种类型， 13条谷胱甘肽硫转移酶在至少7个组织部位广泛高表达；12条谷胱甘肽硫转移酶表达范围相对较窄。而依据谷胱甘肽硫转移酶基因时间分布的特点，飞蝗谷胱甘肽硫转移酶大致可分为卵期高表达和若虫-成虫高表达两大类，其中12条谷胱甘肽硫转移酶在卵期相对高表达。课题组在调取飞蝗基因全长的基础上进一步通过原核表达、Ni-NTA亲和纯化技术，纯化获得25个SDS-PAGE纯的重组飞蝗谷胱甘肽硫转移酶蛋白，并全面测定其底物谱和动力学常数。结果表明25个谷胱甘肽硫转移酶具有针对CDNB、FDNB和NDB-Cl的催化活力，19个谷胱甘肽硫转移酶具有针对DCNB的活力，8个谷胱甘肽硫转移酶具有催化pNPB的酶活力，而18个谷胱甘肽硫转移酶具有催化pNBC的能力。本课题组首次发现飞蝗谷胱甘肽硫转移酶具有依赖于谷胱甘肽的过氧化氢水解的高谷胱甘肽过氧化物酶活力。PAML分析表明，飞蝗谷胱甘肽硫转移酶的delta家族基因中成员间存在4个阳性选择位点，其中2个位于C-端结构域(I193和T199)，2个位于N-端结构域(V9和G11)。在此基础上通过RNAi技术干扰二龄飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因并配合西维因和马拉硫磷药物处理，结果发现LmGSTs5干扰后，马拉硫磷对二龄飞蝗的致死率增加26.1%，而LmGSTs3、LmGSTs5和LmGSTd6干扰后，西维因对二龄飞蝗的致死率分别增加38.7%, 28.2%, and 12.0%。..本课题在国内外重要学术期刊发表研究论文7篇。其中SCI论文4篇，国内核心期刊3篇，培养硕士生4人