基于TLRs/NF-κB信号通路的“黄芩-黄连”药对防治胰岛素抵抗作用机制研究

The principal pathogenesis of insulin resistance (IR) of type 2 diabetes mellitus of chinese medical science is dryness-heat abundance because of high fat diet, alteration of intestinal flora,inflammatory reaction. Which is related with the disturbance of intracellular TLRs/NF-κB signal pathway of glucose transport. We discovered that scutellaria-coptis herb couple significantly decreased blood sugar and berberine can increase glucose consumption;according to reports in the literature, baicalin and berberine can inhibit NF-κB activation, and berberine can improve the intestinal flora, reduce chronic inflammation, and treat diabetes. we propose hypothesis that the effect of anti-insulin resistance of type 2 diabetes mellitus is related with the TLRs/NF-κB signal pathway.We will observe the mechanism of TLRs/NF-κB signal transduction of insulin resistance of type 2 diabetes mellitus by diabetic KKAy mice model, two representative cell model (3T3-L1 cells and RAW264.7 macrophages）,the co-culture of these two kinds of cells,and by using ELISA,western blot,fluorescence quantitative PCR, denaturant gradient gel electrophoresis technology and so on. Further analysis of the mechanism of signal transduction of scutellaria-coptis herb couple in the treatment of insulin resistance,which would provide new approach and new target for prevention and cure of IR.

2型糖尿病胰岛素抵抗（IR），多由长期过食肥甘，肠道菌群失调，炎性反应，终致内热，与信号通路TLRs/NF-κB障碍有关。我们发现，清热燥湿经典药对"黄芩-黄连"能降低血糖，方中成份小檗碱可增加葡萄糖消耗量，又据文献报道，黄芩苷和小檗碱可抑制NF-κB 活化，且小檗碱可改善肠道菌群结构，减轻慢性炎症，治疗糖尿病。本课题提出""黄芩-黄连"药对（SC)治疗IR作用，可能与TLRs/NF-κB信号通路有关"（假说）；拟通过KKAy糖尿病小鼠，3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗和RAW264.7巨噬细胞炎症模型，以及这两种细胞共培养实验，观测SC干预TLRs/NF-κB信号通路防治胰岛素抵抗作用。结合Western blot法检测蛋白水平，荧光定量PCR法测mRNA表达量，变性梯度凝胶电泳法分析肠道菌群，在原工作基础上，进一步分析SC治疗胰岛素抵抗可能信号机制，为中医药治疗IR提供新靶点和新途径。

2型糖尿病胰岛素抵抗属于祖国医学“消渴证”范畴，多由长期过食肥甘，致积热内蕴，终发为消渴证，与肠道菌群失调及炎症信号通路TLRs /NF-κB障碍有关。“黄芩-黄连”药对为临床最为常用的清热解毒药对之一，主治糖尿病等症。我们研究了“黄芩-黄连”药对（SC）防治胰岛素抵抗（IR）作用可能信号转导机制，取得如下成果：（1）我们采用HPLC法对SC中黄芩4种成份和黄连4种成份进行了含量测定，利用液质联用技术共推断出SC提取物中8个化学成分入血；（2）SC可降低 KK-Ay小鼠的空腹血糖、空腹血胰岛素、糖化血红蛋白、糖化血清蛋白、血清甘油三酯、总胆固醇水平、内毒素水平、TNF-α和IL-6含量，升高高密度脂蛋白含量；还可调节肠道菌群；可降低 KK-Ay小鼠结肠TLR4和MyD88蛋白含量；（3）采用蛋白质组学技术筛选鉴定出肝差异蛋白共950个差异蛋白和107 个骨骼肌差异表达蛋白质；（4）SC可调节L6骨骼肌细胞IR模型糖代谢，进而可改善肌细胞IR；（5）SC可显著降低RAW264.7 细胞炎症模型IL-6、TNF-α含量，降低TLR4和MyD88蛋白水平，降低TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA表达量，抑制NF-κB转位；采用蛋白质组学技术筛选鉴定RAW264.7 细胞模型肝差异蛋白950个；采用转录组学方法探寻了RAW 264. 7细胞的mRNA差异表达基因有292个，我们还采用RT-PCR对部分经转录组学技术得到的差异基因进行了验证；（6）另外，我们还采用HPLC和代谢组学研究了SC三种不同配比的物质作用基础，为探讨SC防治IR的配伍机制提供理论基础；另外，因“黄芩-黄连”药对是组成经典方剂葛根芩连汤的重要药对，因此，我们也对葛根芩连汤进行了相关研究。通过本项目研究，有助于SC进一步开发应用，为中医药多靶点多途径治疗2型糖尿病提供新靶点和新途径，为2型糖尿病研究奠定实验基础，并提供临床应用依据，因此，具有十分重要的意义。