CRSIPR/Cas系统在酵母途径工程中的调控与应用

Saccharomyces cerevisiae exhibits many ideal intrinsic attributes as a broadly used microbial factory to produce numerous medicine, food and chemicals. The low efficiency of traditional multi-gene knockout and knockdown techniques have limited better application of engineered yeast on natural product biosynthesis. Based on the high transcription efficiency and selectivity of CRSIPR/Cas system, this project is set to investigate the design principle and functional expression of CRSIPR/Cas in Saccharomyces cerevisiae, to explore the optimization of multi-gene regulation and application in β-amyrin pathway engineering, thus to realize the balanced regulation between endogenous and exogenous pathway in Saccharomyces cerevisiae. The carryout of this project would provide new approach in the complicated multi-pathway reconstruction and multi-gene manipulation in Saccharomyces cerevisiae.

酿酒酵母因其安全、遗传背景清楚被广泛地应用于医药、食品和化工等领域重要产品生产的途径重构中，由于现有基因调控方法在多基因敲除和下调过程中效率较低，限制其在重要天然产物生物合成中的应用。鉴于CRSIPR/Cas系统在古细菌中高效、专一调控目标DNA的转录而调节自身免疫力的作用机制，本项目拟探索CRISPR/Cas系统在酿酒酵母细胞中的设计原理和作用规律，研究CRISPR/Cas系统在多基因调控中同时敲除和下调中的主要影响因素和调控规律，优化获得该系统在酿酒酵母中的最佳表达方式，从而建立CRISPR/Cas系统在酿酒酵母途径工程中多基因调控的设计和组装方法，并将其应用于重要三萜化合物β-香树脂醇的途径工程优化中，实现酿酒酵母外源途径与内源途径的高效平衡调控，为在酿酒酵母中进行复杂途径重构的多基因可控调节提供新思路和新方法。

甘草次酸（GA）是一种五环三萜化合物，具有多种生理活性，被应用到食品、医药和化妆品等许多领域。课题组前期已在酿酒酵母中成功实现了甘草次酸的生物合成，但是由于酵母自身代谢网络极其复杂，外源代谢途径极易被内源途径影响，其重要前体物乙酰辅酶A和β-香树脂醇供应不足及酿酒酵母中内外源代谢途径不平衡导致甘草次酸产量较低, 大大限制了其规模化生产和广泛应用。CRISPR/Cas9是一种简单有效的基因编辑工具，可以同时对多个基因进行插入删除或者替换，也可对代谢途径中多个关键基因进行下调或上调，被广泛应用于代谢工程领域。本研究在生产β-香树脂醇的工程菌株SGibSd中成功构建CRISPR各系统，在SGibSd中，利用CRISPRa上调甾醇合成途径的转录激活因子UPC2，β-香树脂醇产量较出发菌株提高了23%；利用CRISPRa同时上调ALD6、CAB1和UPC2时，β-香树脂醇的产量是出发菌株的2.14倍。在生产甘草次酸的菌株GA104中，利用CRISPRa上调β-香树脂醇合酶βAS基因，获得优化的工程菌株GA104-14，其甘草次酸的产量达18.46 mg/L，较出发菌株提高了7.3倍。.本项目在生产天然产物的工程酵母中成功构建CRISPR各系统，并对合成β-香树脂醇和甘草次酸的内外源代谢途径平衡方面进行了许多探索和研究。最终使得甘草次酸产量达18.46 mg/L。为后续的β-香树脂醇和甘草次酸的高效合成和工业化应用提供了关键理论基础。