血红素结合蛋白BCD1参与调节纤毛协调运动的机制

Motile cilia are widely distributed on the epithelial cells of tracheal and encephalocoele, and their coordinated beating is the premise for transporting the mucus and bacteria out of human body and circulating the fluid in encephalocoele of brain. However, the mechanism of coordinated beating of motile cilia is unclear. We will take advantage of the beating coordination mutants obtained from Chlamydomonas, a model of classic motile cilia research. Based on that one of the mutated genes encoded a heme-binding radial spoke proteins (BCD1), we will identify the interacting proteins of BCD1 using the yeast two hybridization and BioID techniques，and determine the localization of BCD1 in radial spoke and the roles of BCD1 in assembling the radial spoke complex using the EM and sucrose gradient centrifugation methods. Then, we will determine the amount of heme in flagella and the functional significance of the binding the BCD1 with heme in coordinating the beating of multi-cilia. In addition, we will set up an in vivo method to quantify the dynamics of redox in flagella and illuminate the relationship between oscillation of redox in cilia and beating coordination of motile cilia. Finally, we will reconstitute the redox regulation pathway involved in the coordination of ciliary beating by using the mutants and isolated nucleus-basal body-flagella complex. These works will make great contribution in understanding the formation of motile cilia related ciliopathies and shed new light in treating these diseases.

运动纤毛分布于人体呼吸道、脑室等上皮细胞表面，它们之间的协调运动是机体排出粘液、细菌等异物和促进脑液循环的前提，但控制多纤毛协调运动的机理还不清楚。本项目以模式生物衣藻的鞭毛运动协调失衡突变体为研究材料，根据其突变基因（bcd1）编码鞭毛轴丝辐条蛋白并含有血红素结合结构域的特点，将利用酵母双杂交和BioID等技术鉴定鞭毛静止和协调运动时与BCD1互作的蛋白；将利用电镜和蔗糖梯度离心等技术研究BCD1在辐条中的精细定位及其在辐条形成中的作用；将利用代谢组学等方法检测鞭毛中血红素的含量和组成，以及与BCD1结合在纤毛协调运动中的作用。将建立基于荧光蛋白的鞭毛内氧化还原态实时检测方法，阐明纤毛协调运动与鞭毛内氧化还原动态变化的关系。最后，利用突变体和分离的核-基体-鞭毛复合物，构建调控鞭毛协调性运动的鞭毛内氧化还原通路。该研究将为阐明运动纤毛异常所致纤毛病的成因以及相应纤毛病的治疗提供理论支持。

运动纤毛分布于人体呼吸道、脑室等上皮细胞表面，它们之间的协调运动是机体排出粘液、细菌等异物和促进脑液循环的前提，但控制多纤毛协调运动的机理还不清楚。本项目以模式生物衣藻的鞭毛运动协调失衡突变体bcd1 (现改名为cyb5d1）为研究材料，完成了cyb5d1突变体协调失衡表型的精细分析、CYB5D1蛋白的定位及相互作用蛋白的鉴定；验证了CYB5D1与血红素的相互作用；实现了对鞭毛内氧化还原态的检测；解析了CYB5D1在鞭毛协调性建立和维持中的作用。得到以下重要成果：cyb5d1突变体中纤毛运动协调失衡是由于cis-鞭毛的异常所致。CYB5D1是一个新的辐射轮条蛋白，位于其杆状部分。在鞭毛中CYB5D1存在氧化态和还原态，只有氧化态的CYB5D1才能以等摩尔的比例与血红素结合，利用荧光蛋白显示突变体鞭毛中的氧化还原电势降低，外源添加氧化剂可部分拯救突变体表型，生化和遗传学实验说明纤毛内存在由中央微管，到辐射轮条再到外动力臂的氧化还原信号通路控制多纤毛的协调运动，CYB5D1在其中起到整合纤毛内外氧化还原信号的作用。斑马鱼cyb5d1突变体中运动纤毛协调运动异常说明CYB5D1功能和作用机制的保守性。该项目鉴定出新的保守的辐射轮条蛋白，为原发性纤毛运动障碍 (primaryciliarydyskinesia，PCD) 病人的提供了候选突变基因。首次证明纤毛内存在血红素，并能特异性的与CYB5D1结合，氧化还原通路参与多纤毛协调性运动。这些成果为进一步研究多纤毛协调运动的机理积累了材料和方法，为阐明运动纤毛异常所致纤毛病的成因以及相应纤毛病的治疗提供理论支持。