N-糖基化修饰在纤毛膜蛋白的运输及功能调节中的作用

Cilia/flagella are widely distributed in protist and vertebrates, functioning as motile, sensory and secretory organelles. The last two categories of functions are dependent on the ciliary membrane proteins. It has been demonstrated that some of them are N-glycosylated; however, the roles of N-glycosylation on trafficking and regulation the function of flagellar/ciliary membrane proteins are unknown. To address these questions, first, we will isolate the pure flagella and flagellar membrane, and use them as materials to identify the N-glycosylation sites of these flagellar membrane proteins, then isolate their insertional mutants and analyze their flagellar phenotypes. In addition, we will mutate the N-glycosylation sites to determine their roles in ciliary trafficking and in regulation their functions in cilia. Second, we will use the fluorescence labeled Con A or fuse GFP with the glycosylated flagellar membrane proteins to study their dynamics in flagella. The role of Intraflagellar Transport (IFT) in their dynamics will be determined by using a temperature sensitive mutants of anterograde motor. Finally, we will take advantage of inhibitor and mutants of N-glycosylation pathway to pinpoint their roles in modulation of sensory and motile functions of cilia and in regulation the distribution in flagellar membrane proteins by using the quantitative proteomic techniques. These studies will speed our understanding the roles of N-glycosylation in maintaining the structure and function of primary cilia.

纤毛/鞭毛是一类存在于原生动物和脊椎动物细胞表面的细胞器，除执行运动功能外，还执行感受和分泌功能，后二者主要依赖于纤毛中特有的膜蛋白，目前已知很多重要的纤毛膜蛋白都被N-糖基化修饰，但N-糖基化对纤毛膜蛋白的运输及功能调节中的作用还不清楚。本项目首先利用分离纯化得到的鞭毛和鞭毛膜来鉴定鞭毛膜蛋白的糖基化位点，筛选糖基化鞭毛膜蛋白缺失突变体，分析其与鞭毛相关的表型。然后突变糖基化位点，分析N-糖基化对鞭毛膜蛋白运输和功能的影响。其次利用与糖基化蛋白结合的Concanavalin A或荧光蛋白融合技术，分析糖基化膜蛋白在鞭毛中的运动规律，以及与Intraflagellar transport的关系。最后，利用N-糖基化通路的突变体和抑制剂，研究N-糖基化对纤毛膜蛋白的运输以及对纤毛的感受等功能的影响。这些研究将为揭示N-糖基化在维持初级纤毛的正常结构和功能中的作用，以及与纤毛病的关系打下基础。

鞭毛也称纤毛，广泛分布于原生动物和脊椎动物中，具有运动、感受和分泌功能。纤毛膜蛋白如视网膜色素蛋白（opsin）和鞭毛滑动相关的鞭毛膜蛋白FMG-1B都发生了N-糖基化修饰。但N-糖基化修饰在调控纤毛膜蛋白的运输和功能中的作用还不清楚，纤毛膜上的N-糖基化蛋白的种类及N-糖基化位点也尚未被鉴定。..本研究运用生物化学、蛋白质组学、糖组学、遗传学和细胞生物学的方法，以模式生物莱茵衣藻为材料对鞭毛N-糖基化修饰的蛋白种类、糖基化位点以及糖链的结构进行了系统鉴定，并对糖基化修饰在鞭毛滑动中的功能进行了研究。得到以下重要结论：1.N-糖基化蛋白特异性的分布在衣藻营养细胞、配子细胞及合子细胞鞭毛中，有些糖蛋白的糖链结构在有性繁殖的不同阶段发生了变化，表明N-糖基化修饰可能直接参与调控鞭毛有性生殖过程；2.利用插入片段随机整合到基因组的原理，构建了一个容量为15万个单克隆的突变体库，并从该突变体库中成功筛选到了两个编码N-糖基化修饰通路的基因IMMan1A、IMXYLT1A的插入突变体，利用糖组学研究发现这些株突变体的N-糖基化修饰链的发生了显著变化。3.鞭毛表面膜蛋白N-糖基化修饰的异常不影响FMG-1的鞭毛定位和鞭毛滑行速率，但导致鞭毛滑行运动中的粘附力降低，说明鞭毛的粘附与鞭毛的滑行并不是完全偶联的。4.IMMan1A等糖基化突变体具有高盐耐受性，并据此筛选到多个可能的糖基化通路突变体。..本研究鉴定出的多个衣藻鞭毛特有的N-糖基化蛋白和糖基链，为研究N-糖基化在衣藻有性生殖以及纤毛感受和分泌中的作用打下了基础。对纤毛滑行和粘附关系的阐明将拓展对纤毛滑行机理以及生理学意义的认识和研究。多个衣藻N-糖基化修饰突变体的获得和鉴定，将有助于揭示衣藻N-糖基化过程和机制，并为将衣藻建成具有表达人源糖基化修饰的药用蛋白工厂做好准备。