瑞氏木霉纤维二糖转运蛋白CBT1的结构功能及其在纤维素酶基因诱导表达中的作用机制

The cellulase system produced by most cellulose degrading filamentous fungi represented by Trichoderma reesei can be rapidly induced by cellulose, but the regulation mechanism remains unclear so far. It is generally believed that cellobiose, which the major product of cellulase-mediated hydrolysis, might be the real signal molecule released from insoluble cellulose, since it can efficiently induce the cellulase gene expression. The cellobiose transporter system from T. reesei was initially suggested in 1990s by tracking the radio-labelled cellobiose substrates, but the identification of this system has been elusive so far. The present project aims to carry out in-depth research on the novel cellobiose transporter CBT1 recently identified from T. reesei, including characterization of its substrate specificity and dissection of its essential structrual region involved in cellobiose binding and translocation. Furthermore, we will try to investigate the regulatory role and mechanism of CBT1 in the regulation of cellulase gene expression. This study is expected not only to extend the structural and functional understanding on eukaryotic sugar transporters, but also contribute to elucidating the mechanism of signal formation and transfer in the regulation of cellulase gene induction at the molecular level.

以瑞氏木霉为代表的大部分丝状真菌所产的纤维素酶受纤维素诱导表达，但目前诱导表达机理尤其是信号形成与传递机制仍不清楚。纤维二糖是纤维素水解产物的主要成分，同时也能诱导纤维素酶基因表达，被认为极可能是纤维素诱导中的信号分子。瑞氏木霉的纤维二糖转运系统早已被证实存在，但至今未得到鉴定。我们最近在瑞氏木霉中鉴定到了一种新型纤维二糖转运蛋白CBT1，本项目拟对该新型纤维二糖转运蛋白展开深入研究，首先明确CBT1对纤维二糖的转运功能及底物特异性，然后重点解析其参与纤维二糖分子转运的结构基础和转运机制，在此基础上，阐明CBT1在瑞氏木霉纤维素酶基因诱导表达中的作用与机制。本研究不仅拓展真核生物糖转运蛋白的结构功能研究，而且有助于分子水平上揭示纤维素酶基因诱导表达过程中的信号形成与传递机制。

木质纤维素的开发利用对社会经济发展和环境保护等具有重要意义。丝状真菌瑞氏木霉受纤维素底物诱导合成大量的纤维素酶，已广泛应用于工业生产中。但是目前以瑞氏木霉为代表的丝状真菌纤维素酶诱导表达机理尤其是信号感应与传递机制仍不清楚。人们普遍认为纤维素的主要水解产物纤维二糖是诱导信号分子，基于此种观点，我们展开了对瑞氏木霉细胞膜糖转运蛋白的鉴定和研究。我们鉴定到一个能够转运纤维二糖和葡萄糖的转运蛋白Stp1(立项申请书中名为CBT1)，发现其缺失能够引起纤维素酶基因转录水平大幅度上调，表明Stp1在纤维素酶诱导表达中发挥抑制作用。我们通过比较分析野生型菌株与Stp1缺失突变株的基因表达谱鉴定到糖转运蛋白Crt1，其缺失彻底摧毁纤维素酶基因转录表达，表明其在纤维素酶诱导中发挥重要作用。Crt1是纤维二糖转运蛋白的同源蛋白，但并不具有纤维二糖转运活性，被认为发挥感应作用。另一方面，源于丝状真菌的糖转运蛋白的结构功能研究较少，我们对糖转运蛋白Stp1进行了体外的功能描述，并采用点突变的方法鉴定到一些影响其葡萄糖转运活性的重要的氨基酸位点。位于底物结合腔附近的保守残基Phe 50突变为亲水性氨基酸Asn或Gln，或小氨基酸Ala 或Gly，能够显著得提升Stp1的葡萄糖转运活性；位于Stp1 N-结构域侧面而非底物结合腔面的Ile 115和Phe 214位点在Stp1的底物转运功能中也发挥着重要作用，双突变I115F和P214L显著提升Stp1的葡萄糖转运活性。上述研究结果丰富了丝状真菌纤维素酶诱导表达机理研究以及膜转运蛋白研究。