转录辅抑制复合物Cyc8-Tup1在瑞氏木霉纤维素酶基因转录激活中的作用机制

Precise control of gene transcription is key for cells to rapidly respond to the extracellular signals, which involves the transcriptional activation and repression occurred to specific genes. The transcriptional corepressor Cyc8-Tup1 is one of the representative corepressors in eukaryotes, which play an important role in gene repression. Unexpectedly, we found that the homologues of Cyc8-Tup1 in T. reesei (hereafter named TrCyc8-Tup1) is necessary for the activation of cellulase genes, as indicated by the observation that cellulase production was almost abolished when Cyc8 or Tup1-encoding genes were knocked down. The present application aims to elucidate the mechanism underlying the action of TrCyc8-Tup1 in cellulase gene regulation. Systematic studies will be firstly carried out to analyze the dynamic changes undergone by TrCyc8-Tup1 upon cellulase induction. Attempts will also be made to screen and identify other unknown factors cooperating with TrCyc8-Tup1 and to dissect their interactions. Moreover, we will also study the role of TrCyc8-Tup1 in maintenance of the specific chromatin structure as well as the mechanism involved. The results are anticipated not only to extend the understanding on the roles of Cyc8-Tup1 in transcriptional gene activation, but also to provide deeper insights into the regualtion system for T. reesei cellulase synthesis, or to help genetically engineer T. reesei strains to improve cellulase production.

基因的精准转录调控包含特定基因的转录激活和转录抑制，是生物响应外界环境信号的重要保障。Cyc8-Tup1是真核生物典型的转录辅抑制因子之一。我们在前期研究中却发现，模式丝状真菌瑞氏木霉中的同源蛋白TrCyc8-Tup1对纤维素酶基因的转录激活是必需的，其编码基因的敲低几乎摧毁了纤维素酶基因转录表达。本申请拟围绕TrCyc8-Tup1在纤维素酶基因转录激活中的作用机制展开系统研究，首先解析TrCyc8-Tup1在纤维素酶基因由转录抑制状态转向激活状态过程中发生的动态变化；并进一步鉴定与TrCyc8-Tup1协作发挥作用的转录调控因子，明确它们之间的招募互作机制；在此基础上，探究TrCyc8-Tup1及协作的调控因子对基因调控区染色质结构的影响以及影响机制。该研究将在分子水平上进一步揭示丝状真菌纤维素酶基因诱导表达调控机理，并为构建高产纤维素酶菌株提供理论依据。

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei，又名瑞氏木霉）是自然界中降解纤维素的代表性真菌。在纤维素底物存在时，它能够快速高效地启动纤维素酶基因转录表达，合成大量的纤维素酶。纤维素酶基因转录表达调控的精准性和高效性赋予了里氏木霉快速响应碳源转换的生理学特性，也使其成为研究真核生物基因转录调控机制的优良模式材料。虽然对于里氏木霉纤维素酶基因转录调控机理已经有了很多研究，但是仍然有许多问题不清楚，包括重要辅激活因子的鉴定以及与主要激活因子XYR1之间的招募互作模式等。CYC8/TUP1复合物是真核生物中典型并且保守的转录辅抑制因子之一。我们在里氏木霉中鉴定到同源蛋白TrTUP1和TrCYC8，采用免疫共沉淀技术分析发现二者确实于体内形成复合物。通过构建相应的编码基因敲低突变体，发现突变体中纤维素酶合成水平和基因转录水平均显著下降，这表明TrCYC8/TUP1在纤维素酶基因转录激活中发挥重要作用，而非是转录抑制。我们对TrCYC8/TUP1的辅激活机制进行了详细研究。结果表明，在诱导碳源纤维素下，TrCYC8/TUP1被特异性招募至纤维素酶基因启动子上，并且这种启动子占据水平依赖于转录激活因子XYR1的存在。进一步研究发现，在Trtup1或Trcyc8基因敲低突变体中，转录激活因子XYR1对纤维素酶基因启动子的结合能力也显著下降，即使是过表达XYR1也不能恢复，这表明TrCYC8/TUP1作为辅激活因子在XYR1对纤维素酶基因启动子的结合过程中发挥重要作用。同时也发现，敲低突变体中纤维素酶基因启动子区域组蛋白不能有效丢失，表明TrCYC8/TUP1的存在有利于染色质结构疏松进而促进基因转录激活。这些结果表明TrCYC8/TUP1是纤维素酶基因转录调控中的重要辅激活因子，并且与XYR1以一种互相依赖的方式被招募至纤维素酶基因启动子行使调控功能。我们在研究中也发现同时过表达XYR1和TrTUP1能够显著促进纤维酶的表达合成，为提高纤维素酶产量提供了有效指导。这项研究不仅进一步揭示了丝状真菌复杂的纤维素酶基因转录调控机理，有助于通过理性设计构建纤维素酶高产菌株，并且为CYC8/TUP1在真核生物中展现出的功能差异性提供了论据。