瑞氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶在纤维素酶基因诱导表达中的功能研究

The filamentous fungus Trichoderma reesei produces and secretes profuse quantities of enzymes that act synergistically to degrade cellulase and related biomass components. The precise nature of the true 'inducer' and the regulation of cellulase formation by T. reesei is still insufficiently understood. Several lines of preliminary evidence have been presented pointing to a role for β-glucosidase in the rapid induction of the cellulase complex during growth on cellulose. However, no data on the engineering of its expression and its effect on cellulase gene expression have yet been reported. In this study, by characterizing the enzymatic properties and cellular localization of a second GH family 1 β-glucosidase (Cel1b), we intend to investigate the effect of disruption of cel1a and/or cel1b gene loci on cellulase gene induction in T. reesei. The corresponding knockout strains are further used to investigate the contribution of intracellular β-glucosidase activities to cellulase induction by cellulose and sophorse. Moreover, roles of cel3b, cel3e, cel3d and other β-glucosidases in the regulation of cellulase would also be examined. The research results will provide important scientific contributions to the biomass-degrading theory of cellulose, but also make for the construction of high-yield cellulase strain.

瑞氏木霉（Trichoderma reesei）具有很强的分泌纤维素酶的能力，但诱导其纤维素酶转录表达的信号分子是什么，其整个纤维素酶系的表达是如何被调控的等问题至今仍没有得到明确和合理的答案。初步的研究结果推测β-葡萄糖苷酶在纤维素酶诱导过程中具有重要作用，但缺乏重要的实验证据。本课题中，针对糖苷水解酶第一家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b的酶学特点和细胞定位，拟构建其基因缺失的一系列菌株，以不同碳源为诱导物发酵培养，通过分析纤维素酶的转录和表达水平，阐明β-葡萄糖苷酶在信号分子形成及纤维素酶转录调控过程中的功能及其作用机制。同时，研究其他明显受诱导的β-葡萄糖苷酶基因如cel3b, cel3e以及cel3d在纤维素酶表达调控中的作用。该项目的完成将为进一步丰富和完善纤维素的生物降解理论提供重要的科学贡献，也为构建高产高效纤维素酶菌株奠定基础。

本项目在前期研究基础上，围绕β-葡糖糖苷酶如何调控纤维素酶基因的诱导表达这一科学问题展开研究。通过构建一系列基因突变菌株，以不同碳源为诱导物发酵培养，分析纤维素酶转录和表达水平，阐明β-葡萄糖苷酶在信号分子形成及纤维素酶转录调控过程中的功能及其作用机制。主要研究结果如下：一是β-葡糖糖苷酶在纤维素酶诱导表达中起重要作用。构建了cel1a，cel1b分别缺失，cel1a、cel1b同时缺失，bgl1、cel1a、cel1b三基因同时缺失（ΔtriβG）的突变株，发现cel1a基因的缺失会导致结晶纤维素和乳糖诱导纤维素酶表达滞后；cel1a、cel1b以及bgl1基因同时缺失能加重结晶纤维素诱导纤维素酶基因表达的延迟，并且完全消除乳糖对纤维素酶的诱导。二是Δcel1a菌株纤维素酶表达的恢复可能与纤维二糖有关，而与半乳糖的代谢无关。补充纤维二糖可以恢复Δcel1aΔcel1b和ΔtriβG中纤维素酶基因的正常表达；而补充半乳糖只能恢复Δcel1a中纤维素酶基因的表达，Δcel1aΔcel1b和ΔtriβG中的纤维素酶基因正常表达无法恢复，且在Δcel1a中敲除胞外半乳糖苷酶基因bga1后纤维素酶的表达没有进一步受到影响。三是β-葡萄糖苷酶的缺失会影响转录因子XYR1和乳糖转运蛋白CRT1的表达。Δcel1a菌株中转录因子XYR1和乳糖转运蛋白CRT1在乳糖上的转录受到了严重的影响，在添加半乳糖的情况下，Δcel1a菌株中xyr1和crt1的转录得到了恢复，但这种恢复在Δcel1aΔcel1b菌种中没有发生。在双缺菌株Δcel1aΔcel1b中组成型表达CRT1和XYR1，虽然这两个基因的转录得到了恢复，但是纤维素酶的表达却没有恢复，说明β-葡萄糖苷酶不仅仅影响了这两个转录因子的表达，恢复其表达水平不足以使得纤维素酶表达恢复。四是β-葡萄糖苷酶的缺失影响cbh1启动子蛋白复合物的形成。通过EMSA检测诱导和非诱导条件下野生型和突变株中cbh1启动子蛋白复合物的迁移率，发现β-葡萄糖苷酶缺失之后形成了与野生型不同的cbh1启动子蛋白复合物。本项目的研究结果表明胞内β-葡萄糖苷酶对纤维素酶的快速诱导表达是必要的。在项目执行过程中获得授权国家发明专利2项，一篇关于瑞氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶的研究综述已经被中文核心期刊《中国农业科技导报》接受（待刊出），另一篇SCI论文在审稿中。