胁迫和葡萄糖条件下隐球菌四跨膜蛋白Tsp2-1蛋白互作组（interactome)构建

Sensors for glucose and other stress conditions on the cell surface in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans have not been described.In a previous study, we found that a membrane protein belonging to the tetraspanin superfamily, named Tsp2-1 in C. neoformans, was involved in glucose sensing and the reposne to osmotic pressure, high temperature and oxidative stress. Utilizing the modified membrane yeast two-hybrid technique (MYTH),this proposal is intended to mapping the functional Tsp2-1 interactome first. Based on the interactome, we are going to identify the putative glucose sensor, and proteins responsible for the signals against osmatic,heat, SDS and oxidative presures.And the interactome map will also indicate the corelationship of Tsp2-1 to the classic signal transduction pathways such as G-protein-cAMP-PKA and HOG MAPK pathways. And we are also interested in testing the hypothesis that there might be undescribed signal pathways for heat,osmatic,SDS and oxidative stress conditions in C. neoformans. This work will shed new light on the pathogenic mechanism in the fungus.

新型隐球酵母细胞表面的葡萄糖受体和渗透压感应蛋白（sensors）尚未被描述。本小组的前期研究发现隐球菌位于细胞膜上的四跨膜蛋白（tetraspanin）Tsp2-1参与了葡萄糖感应和抗高渗透压、高温和氧化等胁迫。本计划拟采用"膜蛋白酵母双杂交(MYTH)"或者Co-IP等技术手段，获得在此等条件下与Tsp2-1相互作用的蛋白组（interactome）信息，进而鉴定出隐球菌对高浓度葡萄糖和高渗高温等胁迫条件的感应受体和信号产生的早期步骤；探讨Tsp2-1与已知的经典信号传导通路的关系；回答隐球菌中是否存在应答H2O2、SDS和高温等胁迫的信号通路等问题。由于Tsp2-1是膜蛋白，本计划将有助于揭示隐球菌与环境/宿主识别、相互作用的最初过程，为阐明隐球菌致病性机制提供新数据。

葡萄糖是致病真菌隐球菌毒力因子和致病性的重要调节因素，但是其信号网络至今仍然未知。本课题以四跨膜蛋白Tsp2-1为切入点，继续寻找与葡萄糖信号通路相关的调控因子新成员。完成了Tsp2-1蛋白关键的机构分析，和不同条件下Tsp-2-1亚细胞定位。首次获得该真菌中73个环状RNAs，其中一个产生于GTPase编码基因上的一个circRNA具有宿主保守性，并且在tsp2-1突变中敲除该基因，回复了tsp2-1突变株的表型。研究还鉴定出新的毒力因子表达调控相关的FLC1基因，编码真菌特有的flavin载体蛋白，突变该基因影响葡萄糖对黑色素合成、荚膜生成以及毒力，特别是该基因为真菌抗药所必需。另外一个有意义的发现是鉴定出一个果蝇同源Vilse家族的GTPase激活蛋白（GAP），Cvh1, 参与葡萄糖抑制毒力因子漆酶的表达，这是在该真菌中首次发现GAP参与葡萄糖调节毒力因子表达过程。在构建Tsp2-1的蛋白互作组过程中，遭遇膜蛋白异源表达的困难，使得构建互作组工作仍在进行中。在该课题经费的支持下，共发表研究论文13篇，其中SCI收录论文11篇（基金号为第一标注, 责任作者）。组织学术会议一次，在国内学术会议上做大会报告4次。