新型β-内膦酰胺与荧光β-内酰胺类的合成和对金属β-内酰胺酶及其耐药细菌的广谱抑制研究

The antibiotic resistance in bacteria induced by metallo-β-lactamases (MβLs) including the NDM-1 has resulted in the clinical crisis, people pay close attention to the design and synthesis of broad-spectrum inhibitors and photosensitive compounds with MβLs and the drug-resistant bacteria as targets. The project intends to do expression and purification of the MβLs from each subclass of them, based on the same transition state mechanism of MβLs catalyzing substrate hydrolysis, design, synthesis and characterization of a series of β-phospholactams as the transition state analogs which can identify MβLs and antibiotic resistant bacteria, construction of a series of the fluorescence β-lactams with the photodynamic inactivation of the antibiotic resistant bacteria with MβLs, evaluation of the inhibition activity and inhibition type of the β-phospholactams with steady-state kinetics, testing their synergies in combination with antibiotics to inhibit MβLs and the antibiotic resistant bacteria (eg Pseudomonas aeruginosa) with MIC method, determination of the thermodynamic parameters of them inhibiting MβLs with the microcalorimetric titration, and the photodynamic method for determination of the inactivation rate of the fluorescence β-lactams against the antibiotic resistant bacteria. With modern spectroscopic techniques including single crystal x-ray spectroscopy, at the molecular level, systematic studies on the interaction of the inhibitors and MβLs and the structure-activity relationship. Through this project, creating and finding the β-phospholactam and fluorescence β-lactam compounds as broad-spectrum inhibitors of MβLs and drug-resistant bacteria for the development of new antimicrobial agents to provide information of significant value.

金属β-内酰胺酶(MβLs)包括NDM-1引起的细菌耐药导致临床医学危机，以MβLs及其耐药菌为靶标设计合成广谱抑制剂和光敏化合物是目前人们密切关注的热点。本项目拟表达纯化每个组别的MβLs，根据其催化底物水解形成相同过渡态的机理特征，设计合成和表征一系列具有识别MβLs及其耐药菌的过渡态类似物型β-内膦酰胺，构建一系列对MβLs耐药菌具有光动力学活性的荧光β-内酰胺，动力学评价其对MβLs的抑制能力和抑制类型，MIC测试其与抗生素联合抑制MβLs耐药菌（如铜绿假单胞菌）的协同效应，微量热法测定其抑制MβLs的热力学参数，光动力学法测定其对MβLs耐药菌的灭活率等。用单晶X-衍射等现代光谱技术,在分子层次上系统地研究抑制剂与MβLs的作用及其构效关系。通过本项目研究，创造和发现对MβLs及其耐药菌有广谱抑制作用的β-内磷酰胺和荧光β-内酰胺类化合物,为发展新型抗菌药物提供重要信息。

金属β-内酰胺酶(MβLs)是β-内酰胺类抗生素耐药之靶蛋白，以MβLs为靶标设计合成新型β-内膦酰胺及荧光β-内酰胺类酶抑制剂对发展新型抗菌药物具有重要意义。为此，本项目开展了一系列研究工作：1）完成MβLs三个组群三个代表性蛋白CcrA，ImiS和L1的表达纯化，获得了纯度99%以上的靶蛋白，其产率分别为20、7、及25毫克蛋白/每升菌液。发展了一种盐析法纯化CcrA的新方法。制备了抑制剂-VIM2的共结晶体，获得了抑制剂与靶蛋白作用的直接信息；2）成功构建第一个拥有类碳青霉烯双环结构的β-内膦酰胺，它是第一个过渡态类似物型酶抑制剂，其对L1、IMP-1、CcrA、NDM-1及Bla-2具有广谱抑制效能，最高抑制率达94%，对介导“超级细菌”的NDM-1具有53%的抑制率。研究了β-内膦酰胺与NDM-1活性中心的分子对接；3）构建一种新型荧光β-内酰胺，它既是一个MβLs的荧光底物又是一个色谱底物，为快速评价MβLs提供了新方法。这类化合物对金葡菌的MIC值为0.5 mg/mL，对产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌的光动力学灭活率达84%。4）发展了一种荧光万古霉素，靶向性地识别革兰氏阳性菌及其荧光成像，对临床耐药菌枯草杆菌及肠球菌的光动力学灭活率为71%；5）发展了一种卟啉万古霉素，对耐甲氧西林金葡菌MRSA-1及MRSA-2的灭活率高达95%，对“超级细菌”VRE的灭活率为70%。这种缀合物可灵敏地识别革兰氏阳性致病菌，为革兰氏阳性耐药菌的鉴别和灭活提供了新途径。6）发展了一类对L1具有特异性抑制活性的巯基乙酸衍生物，其IC50值达18 nM，而部分化合物对NDM-1、ImiS和L1具有广谱抑制效能，并协同抗生素有效地抑制耐药细菌，使得抗生素的灭菌效能提高2-4倍。点击研究揭示，这些抑制剂分子是通过其羧基与蛋白活性中心的两个Zn（II）离子键合而呈现出抑制活性；7）重组了Zn-MβL及Co-MβL，ITC研究表明，其重组过程是一个不可逆放热过程且伴随有荧光强度的显著增强；8）发展了一种通过ITC筛选酶抑制剂的方法。