辣椒疫霉纤维素合酶复合体的组装机制和生化特征

The oomycete cell wall mainly consists of cellulose. The cellulose synthase complex (CSCs) which catalyzes UDPG to β-1,4-glucan chains, and plays an important role in oomycetes growth and infection of plants, is currently the subject of intensive investigation for potentive targets of fungicides. Up to now, oomycetes cellulose synthases were poorly studied. We have carried out a preliminary study on Phytophthora capsici cellulose synthases. Our results showed cellulose synthase proteins had four isoforms: CESA1, CESA2, CESA3, and CESA4. In addition, CESA1, CESA2, and CESA4 shared the same domains. It was suggested that CESA1, CESA2, and CESA4 were rebundant in assembling of cellulose synthase complex. In addition, previous proteomics study revealed CESA1 was expressed in both mycelium and cysts. This suggested CESA1 played an important role in cell wall biosynthesis. In our study, we will focus on the assemble mechanism and biochemical function of oomycete cellulose synthase complex, with aim to study the existing form of oomycete cellulose synthase complex. In addition, the activity and biochemical characterization of CSCs and individual cellulose synthase proteins will be clarified. This will illustrate the mechanism of cellulose biosynthesis. The study will provide important information of oomycete GT studies, and inform the design of inhibitors to control oomycete infection and growth.

纤维素是卵菌细胞壁的重要成分，主要由纤维素合酶复合体催化UDPG，合成β-1,4-糖苷链聚合形成，其在卵菌的生长发育和侵染过程中具有重要作用，目前已成为国际上探求新型卵菌抑制剂作用靶标的研究热点。迄今关于卵菌纤维素合酶的研究甚少，申请者前期开展了辣椒疫霉纤维素合酶的探索性研究，明确了纤维素合酶具有四个亚基，且CESA1，CESA2和CESA4结构相似，推测在参与纤维素合酶复合体组装和行使功能方面存在冗余；蛋白组学研究发现，CESA1在辣椒疫霉游动孢子和菌丝阶段均有表达，推测其参与了细胞壁形成。本研究拟以辣椒疫霉纤维素合酶复合体组装机制和生化特征为核心，探究纤维素合酶复合体亚基的存在形式；明确纤维素合酶不同亚基及合酶复合体的催化活性和生化特征；揭示辣椒疫霉纤维素的生物合成机制。该研究有望填补卵菌多糖转移酶（GT）家族研究领域的空白，可为基于纤维素合酶的分子靶标为导向的新药物创制提供理论基础。

卵菌的细胞壁与真菌不同，其主要组分为纤维素而非几丁质，纤维素的合成在植物病原卵菌的生长发育和侵染寄主过程中具有非常重要的作用。因此，探求纤维素合成的相关前体物质与相关酶的生化功能特征是国际上新型卵菌抑制剂作用靶标的研究热点。本研究以辣椒疫霉纤维素合酶为研究对象，系统研究了其纤维素合酶复合体的组成形式，生化特征以及生物学功能。. 项目研究中，采用梯度离心法，获了得包含纤维素合酶复合体的辣椒疫霉细胞膜蛋白，外源添加C14-UDPG，结合HPAEC-PAD方法，明确了辣椒疫霉纤维素酶复合体在离体条件下具有形成纤维多聚糖和不可溶纤维素的酶活。采用qPCR方法，明确了辣椒疫霉四个纤维素合酶基因的表达模式，其中CesA1、CesA2、CesA4基因在游动孢子、休止孢及休止孢萌发阶段具有上调表达，而CesA3基因在侵染阶段表达量较高。借助荧光素酶互补试验和免疫共沉淀试验，明确了辣椒疫霉四个纤维素合酶复合体亚基的互作关系，发现其可能通过自互作或不同亚基间的互作组成酶复合体发挥合成纤维素的功能。构建了零背景的酵母突变体，采用酵母异源表达的手段成功表达并纯化CesA1亚基，对其生化功能分析发现CesA1亚基主要催化UDPG形成纤维二糖，具有催化合成纤维二糖活性。. 进一步采用CRISPR-Cas9介导的基因敲除及原位回补技术对辣椒疫霉纤维素合酶进行生物学功能分析，发现CesA1和CesA2亚基在辣椒疫霉休止孢萌发和致病过程中发挥重要作用，CesA4亚基在辣椒疫霉游动孢子形成和致病过程中发挥重要作用，CesA3亚基敲除致死，说明其对辣椒疫霉的生长发育具有至关重要的作用。利用衍生化-气质联用方式对辣椒疫霉细胞壁组成和交联情况进行分析，结果表明CesA1亚基和CesA2亚基在合成纤维素以及纤维素支链中发挥作用，CesA1和CesA2缺失导致辣椒疫霉细胞壁纤维素含量降低，纤维素支链变少，从而导致细胞壁结构发生改变，进而影响辣椒疫霉的极性生长和致病过程。上述研究结果为全面揭示纤维素合酶复合体的组装形式生化特征，并进一步开发以纤维素合酶不同亚基为分子靶标的新型卵菌抑制剂剂提供了参考。