辣椒疫霉对氟噻唑吡乙酮的抗性风险评估和抗性分子机制研究

Plant pathogenic oomycetes could cause many devastating diseases. Currently, chemical control is still one of the most effective methods to control oomycete diseases. However, many fungicides against oomycetes have generated serious resistance problems because of irrational and frequent applying in fields. Therefore, it is imperative to develop new classes of fungicides with new mode of action to control oomycete diseases and to manage resistance problems. Oxathiapiprolin, developed by Dupon in 2007, exhibits a high bioactivity on oomycetes. Affinity chromatography analysis indicated that oxathiapiprolin targeted on oxysterol binding proteins (OSBP) and OSBP-related proteins (ORPs). Until now, there is no any research report about the resistance developing risk and resistance molecular mechanism of the fungicide, and the exact action site in OSBP or ORPs is unknown as well. Based on the above, this project aims to: (i) assess resistance risk of Phytophthora capsici to oxathiapiprolin, (ii) scientifically clarify resistance molecular mechanism of P. capsici to oxathiapiprolin, (iii) establish a rapid molecular method for resistance detection. The results would be helpful for designing new anti-resistance compounds and developing a series of derivatives targeting on OSBP or ORPs. This project could also provide a technical support for rational use of oxathiapiprolin, delaying emergence and development of resistance and early monitoring of fungicide resistance in fields.

植物病原卵菌可导致多种毁灭性的病害，化学防治仍是目前防治卵菌病害最为有效的方法之一。但随着一些内吸性杀菌剂的不合理频繁使用，许多卵菌已经对其产生严重的抗药性，亟需开发全新作用机制的卵菌抑制剂，用于卵菌病害的防治和抗药性治理。氟噻唑吡乙酮是Dupon公司2007年研发的具有超高生物活性的卵菌抑制剂，亲和色谱分析表明其作用靶标为氧化固醇结合蛋白（OSBP）及其相关蛋白（ORPs）。迄今，这种全新的药剂靶标蛋白在植物卵菌中未见报道；药剂与卵菌互作中，药剂在靶标蛋白上的作用位点以及卵菌的抗药性风险和抗药性分子机制均不清楚。本项目拟针对上述空白开展相关研究，评估辣椒疫霉对氟噻唑吡乙酮的抗性风险，系统阐明其抗性分子机制，并建立田间抗性分子检测体系。为新化合物的"反抗性"设计和以OSBP和ORPs为分子靶标的系列衍生物创制提供指导；为田间合理用药、延缓抗药性产生和发展以及开展抗药性早期预警提供技术支持。

氟噻唑吡乙酮是美国杜邦公司2007年研发出的具有全新化学结构及作用机制的新型杀菌剂。本研究室前期研究表明，该药剂对霜霉病菌和疫霉菌表现出优异的生物活性，其对多种靶标菌的EC50值均达到10-4 μg/ml，杜邦公司前期通过亲和色谱等分析，发现该药剂的作用靶标为氧化固醇结合相关蛋白（ORP）。目前关于该药剂的抗性风险、抗性分子机制、靶标蛋白及其相关同源蛋白在疫霉菌中的生物学功能鲜有研究报道。因此，本论文开展了相关研究并取得如下研究结果：1. 采自我国28个省份的175株辣椒疫霉菌株对氟噻唑吡乙酮的抑制中浓度EC50值的范围为3.19 × 10-4 μg/ml到9.86 × 10-4 μg/ml，平均EC50值为5.61 × 10-4 μg/ml，EC50值的频率分布呈单峰分布，表明田间不存在自然的辣椒疫霉抗氟噻唑吡乙酮抗性亚群体，该敏感基线可用于监测田间辣椒疫霉群体对氟噻唑吡乙酮的抗性。2. 通过药剂驯化，获得了两类辣椒疫霉抗药性突变体。其中，LP3系列突变体表现出了优异的生存适合度，其菌丝生长速率、孢子囊产生能力、休止孢萌发能力以及致病性均与亲本相当甚至优于亲本。综合药剂驯化筛选获得抗性突变体的难易程度、突变体的生存适合度及辣椒疫霉自身为土传病害的特征，推测辣椒疫霉对氟噻唑吡乙酮存在中等抗性风险。3. 利用传统过表达遗传转化及CRISPR/Cas9体系定点编辑，证实PcORP1杂合点突变G839W、G770V或纯合点缺失突变∆N837能够引起辣椒疫霉对氟噻唑吡乙酮的高水平抗性；在大豆疫霉PsORP1上的纯合点缺失∆N837亦能引起大豆疫霉对氟噻唑吡乙酮的高水平抗性。具有PcORP1∆N837和PcORP1G770V的辣椒疫霉及具有PsORP1∆N837大豆疫霉突变体均表现出一定的田间生存适合度。针对辣椒疫霉PcORP1点突变G839W，本研究建立了AS-PCR和CAPS两种快速分子检测方法，可以用于田间具有该突变位点的辣椒疫霉抗药性菌株的监测。可以用于田间具有该突变位点的辣椒疫霉抗药性菌株的监测。本项目研究结果将为氟噻唑吡乙酮的田间科学合理使用、抗性管理策略制定和系列同类型卵菌抑制剂的开发提供重要的数据支持。