辣椒疫霉氧化固醇结合相关蛋白功能及结构生物学研究

Plant pathogenic oomycetes, which could cause devastating plant diseases. Currently, the lack of effective oomycete inhibitors and the increasing fungicide resistance in plant pathogenic oomycetes have become serious problems. Therefore, it is pressing and worthwhile to research for new novel oomycete inhibitors and target sites. Oxathiapiprolin is a novel oomycete inhibitor developed by Dupon. It has very high inhibitory activity to oomycetes. Its target protein is PcORP1 in Phytophthora capsici which belongs to a conservative protein family, ORPs(oxysterol-binding protein-related proteins), in eukaryote. So far, the most-studied ORPs are 7 OSH proteins in Saccharomyces cerevisiae and 16 ORP proteins of humans. However, as a novel fungicide target protein, the biological functions and structural features of ORPs in plant pathogenic oomycetes are still not clear. Based on our fungicide-pathogen interaction system, the aims of this project are: (1) to elucidate the biological function and structural feature of PcORP1 and PcORP2 in P. capsici, (2) to definite their biological significance and three-dimensional structure feature, (3) to investigate the binding characteristic of oxathiapiprolin and PcORP1 and clarify the molecular mechanism of oxathiapiprolin, (4) to construct a protein-compound interaction model. The results of this project will provide structure evidence for the development of novel fungicides which target on ORPs.

植物病原卵菌引起的危害多难以控制，而目前卵菌抑制剂的品种相对较少且抗药性问题日益严重，亟需发掘全新药物分子靶标并开发新型杀菌剂。氟噻唑吡乙酮是杜邦公司经盲筛获得的具有超高生物活性的新型卵菌抑制剂。研究表明其作用靶标为氧化固醇结合相关蛋白，属于真核生物中一类保守ORPs蛋白家族。迄今为止，有关ORPs的研究集中在酵母7个OSH蛋白及人类16个ORP蛋白上，而作为一种新型杀菌剂靶标，ORPs在植物病原菌中的生物学功能及结构特征尚不清楚。本课题拟在已建立的植物病原卵菌与杀菌剂互作研究体系基础上，开展氟噻唑吡乙酮靶标蛋白PcORP1及同源蛋白PcORP2的生物学功能及结构生物学研究，明确其生物学意义，并解析其三维结构特征，阐明氟噻唑吡乙酮与靶标蛋白的结合特征，揭示氟噻唑吡乙酮分子作用机制，建立蛋白-化合物相互作用模型，为以ORPs分子靶标为导向的系列新型卵菌抑制剂的开发提供重要蛋白生物学结构依据。

在本项目的资助下，依照项目计划书的内容，开展了疫霉菌ORPs蛋白的生物学功能研究，明确了ORPs互作蛋白种类及其参与的代谢调控途径，探究ORPs的生物学结构特征，建立了ORP1蛋白-配体互作模型，在此基础上，开展了靶向ORP1的核酸农药和靶标农药的创制。通过以上研究工作，顺利完成了项目预期目标，发表论文16篇，申请发明专利6项（已授权3项），培养研究生6名。（1）明确了ORPs蛋白的生物学功能。首先利用基因敲除、沉默、过表达技术，以辣椒疫霉、大豆疫霉为靶标菌，转化获得ORPs的沉默、过表达、荧光标记及定点突变转化子，研究转化子的生物学性状，明确了不同结构域对于ORP1蛋白的亚细胞定位及生物学功能的影响。并采用脂质组学方法进一步明确了ORP1脂质配体类别。（2）采用酵母双杂交及免疫共沉淀技术分析并鉴定ORPs互作的蛋白种类，阐明ORP1蛋白上三个重要结构域（PH结构域，START结构域和ORD结构域分别）的互作蛋白、脂质结合特性或脂质配体种类，分析互作蛋白的生物学特性，探究ORPs可能参与调控的代谢途径，为深入了解疫霉菌ORPs的调控机制提供数据支持，同时为新型杀菌剂创制提供了分子靶标。（3）建立并优化ORPs的全长及重要结构域的异源表达体系和蛋白纯化体系，进行PcORPs全长及截短体重组蛋白结晶条件筛选。进一步通过X射线晶体学技术成功解析PH结构域的三种晶体结构。利用AI结构预测平台AlphaFold2分析了ORP1全长结构，探究了ORP1与其配体的结合互作机制，明确了互作的关键氨基酸位点，建立ORPs蛋白-配体（活性小分子）互作模型，阐释了目标蛋白行使功能的分子机制和结构基础。本项目具有很好的应用前景：采用靶向农药的设计策略，靶向ORP1及其重要结构域，采用分子设计、虚拟筛选和先导优化的方法，研究获得了一类具有开发前景的高活性杀菌剂；同时，采用核酸农药的设计策略并结合纳米碳点的保护和传输作用，获得了靶向ORP1重要区域的dsRNA-CD核酸农药，其对抗性菌株引起的相关病害具有明显的防效，相关研究近期被国际著名期刊ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS接受。