分枝杆菌甾醇侧链氧化关键酶甾酮C27单加氧酶功能鉴定及催化机理解析

Androst-1,4-diene-3,17-dione (ADD) is an important steroid drug intermediate, which plays significant role in pharmaceutical industry. Previously, Mycobacterium neoaurum JC-12 capable of transforming phytosterol into ADD was obtained by isolation and mutation breeding. But the low efficiency of phytosterol side chain oxidative degradation is one of the key bottlenecks that restricts the ADD efficient biosynthesis. Steroid C27 monooxygenase (SMO) is the key enzyme that catalyzes the first step of sterol side chain degradation, which determines the efficiency of sterol side chain oxidative degradation. Therefore, in this project, the enzymatic characteristics of three SMO isoenzymes would be firstly investigated to reveal their substrate catalytic properties and cofactor preferences. Then, the function of SMO isoenzymes in sterol metabolic pathway would be analyzed. Finally, the crystal and 3D structures of complex proteins of wild type and their interactions with cofactor and the substrate would be analyzed to elucidate the catalytic mechanism of SMO. This results could pave a way for improving the ability of mycobacterial sterol side chain oxidation. We have some experiences in the functional analysis of cholesterol oxidase and 3-ketosteroid-∆1-dehysrogenase, which provides good technical support for the implementation of this project.

雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）是一种重要的甾体药物中间体，在甾体药物行业中具有重要的地位。项目组前期经多级诱变筛选获得一株高效转化植物甾醇生成ADD的新金色分枝杆菌JC-12，其甾醇侧链氧化降解效率低是制约ADD高效合成的关键瓶颈之一。甾酮C27单加氧酶（SMO）是甾醇侧链氧化降解途径的第一步关键酶，决定着甾醇侧链氧化降解的效率。因此，本项目拟对利用生物信息学手段筛选到的3个SMO进行酶学特性表征，揭示其底物催化特性和辅因子偏好性；对SMO同工酶在甾醇代谢途径中进行功能鉴定和作用强度分析；通过分析SMO与辅因子和底物相互作用的蛋白复合物三维结构，从分子水平上解析其催化机理，为提高分枝杆菌甾醇侧链氧化降解效率提供理论基础。项目组前期在甾醇代谢途径关键酶胆固醇氧化酶和3-甾酮-∆1-脱氢酶功能解析具有较为丰富的经验，为本项目的实施提供良好技术支撑。

项目对新金色分枝杆菌转化植物甾醇过程中的关键酶进行功能鉴定，利用代谢工程策略结合辅酶循环再生体系，实现了甾体药物中间体雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（ADD）的高效积累。得到如下结论：.1. 鉴定了来源于新金色分枝杆菌的三个SMO同工酶SMO1，SMO2和SMO3具有甾醇侧链末端氧化功能。酶动力学分析表明SMO2对底物亲和性更强，催化效率更高。对其敲除和功能回补进行研究，发现缺陷菌株对底物甾醇的代谢速率受到明显的抑制作用，证实了SMO是分枝杆菌甾醇侧链转化第一步反应的关键酶，过表达SMO1，SMO2和SMO3，结果表明SMO1，SMO2和SMO3过表达菌株ADD的产量分别从3.48 g/L提高到4.49 g/L，4.96 g/L和4.13 g/L，SMO2在甾醇代谢过程中作用最为明显。可以通过提高SMO酶活性来提高菌株转化甾醇合成ADD的能力。.2. 利用代谢工程手段调控M. neoaurum JC-12转化甾醇合成ADD的代谢途径。敲除kshA1基因使KSH活性缺失，阻断ADD降解途径。在KSH活性缺失的基础上，共表达代谢途径中的关键酶ChoM2，SMO2和KSDD提高甾醇代谢途径通量，为了缩短发酵周期，提高ADD生产效率，在5-L发酵罐上对重组菌株发酵调控，以果糖作为初始碳源，消除重组菌生长延滞期，结合多阶段发酵策略，180 h ADD产量达20.1 g/L。这是目前报道中利用甾醇转化合成ADD的最高产量。.本研究鉴定关键酶的功能并通过代谢工程和辅酶循环再生，获得了ADD高产菌株。项目资助期间，相关研究成果发表在Journal of industrial microbiology & biotechnology、Molecules、ACS synthetic biology、Journal of bioscience and bioengineering、化工学报等期刊，获授权国家发明专利2项，为工业化利用新金色分枝杆菌转化植物甾醇合成甾体药物中间体提供借鉴。