分支杆菌植物甾醇侧链降解与辅因子循环相关性研究

The process of side chain degredation of cholesterol and phytosterol by Mycobacteria is comprised of 14 steps Enzymatic reaction, including 9 kinds of enzyme, for the production of steroid drug intermediates. there are many cofactors (such as coenzyme A,NAD+) to participate in these continuing enzymatic reaction. The regeneration of cofactor is crucial to the process of side chain degredation and formation of reductive intermediate (such as hydroxyl product). These hydroxyl products are not suitable substrates to Mycobacteria and easy to accumulate in the process of biotransformation. In the meantime, NADH can be produced in the process of side chain degredation and affect the retio of ATP/ADP/AMP which is relate to side chain degredation and other carbon motabalite. To solve these problems, the side chain degradation of metabolic process analysis, proteomics and genomics analysis, and metabolic control analysis are needed to explain the regulation between regeneration of cofactor and side chain degradation of phytosterol. The results of research can be used to improve the efficiency of phytosterol biotransformation and provide theoretical guidance to related researches.

分支杆菌降解胆固醇、植物甾醇侧链生成甾体药物中间体由至少4个酶系9种酶参与的14步连续酶促反应，同时，参与侧链降解的反应中很多有辅因子（辅酶A、NAD+等）参与，其再生循环利用状况一方面与侧链降解过程中形成的末端还原成羟基的中间产物有关，该类产物不是侧链降解酶系的最适底物，不易被继续代谢而造成积累。另一方面，侧链降解产生的还原力，对细胞能荷也会产生影响，进而对侧链降解过程（碳代谢过程）及菌体中心代谢途径产生影响，降低侧链降解效率。针对这些问题，本课题通过对侧链降解代谢过程分析、组学分析、代谢调控分析的研究，从不同的角度和层面对植物甾醇的侧链降解途径与辅因子再生循环相关性机制与调控进行阐述，揭示其内在规律，对改进植物甾醇的侧链降解过程，提高转化效率提供理论指导。

本项目以前期构建的能够降解植物甾醇侧链的新金分枝杆菌工程菌为研究模板，以植物甾醇生物降解制备医药中间体产业化应用为导向，以侧链降解途径与辅因子再生循环相关性机制与调控为研究目标，从代谢过程分析、组学分析和代谢调控分析三个角度入手，研究辅因子（ATP/ADP/AMP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+、乙酰辅酶A 及其衍生物等）的形式、浓度和循环状态对甾醇转化效率，以及减少副产物生成的影响，阐明辅因子的循环对植物甾醇侧链降解影响的机制，以此为依据建立分支杆菌转化植物甾醇的发酵过程调控及代谢工程改造策略。.分枝杆菌降解代谢植物甾醇能够制备AD、ADD、9-OHAD、HBC等甾体药物中间体，研究从建立高效生物转化体系入手，通过采用静息细胞转化，反应体系中添加助溶剂羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)，有效地提高了转化反应效率，底物浓度达到50g/L，反应时间缩短至4-5天。.进一步对代谢过程和代谢组分析发现，随着细胞内代谢通量的增加，反应产物中还原性产物的比例可相应的大幅提高（50%以上），而且代谢过程中还原力（NADH/NAD+）和能荷（ATP/ADP/AMP）也相应处于较高水平，说明代谢过程中形成的还原力不能有效的循环利用，从而导致代谢流的迁移，生成更多的还原性中间产物。通过构建细胞内耦合氧化还原反应可以有效地消耗细胞内还原力，降低NADH/NAD+水平，从而减少还原性中间产物的比例。同时，碳源（葡萄糖）共代谢实验结果显示，由于Glu代谢可以提供更多的还原力，从而使代谢更多的偏向还原性产物生成的途径，导致还原性产物比例增加。.另外，反应体系中环糊精的加入可严重阻碍氧传递，使得甾醇转化过程中氧利用效率下降，通过呼吸链的辅酶再生受阻，从而导致还原性产物的增加。.同时，对分枝杆菌代谢甾醇基因组的研究分析发现，编码羟酰辅酶A脱氢酶的基因（hsd4A）是影响还原性产物生成的关键，强化该基因的表达，可有效减少还原性产物的生成（<5%）,阻断其表达则大部分生成还原性产物。.项目研究对分枝杆菌甾醇代谢过程中辅因子循环及对代谢流分布造成的影响进行了研究，探讨了其相关性机制，建立了通过代谢途径和代谢过程调控进行改进的方法，为过程调控及菌种的代谢工程改造提供了依据。