花药发育关键转录因子AMS调控甜瓜雄性不育机理研究

Single Nuclear genetic male sterility has stable male sterility and crossing freedom characterize, it is an important germplasm for breeding program. Previous research on fine mapping of male sterility gene in melon identified Aborted Microspores (AMS) expressed gene is the candidate gene for melon male sterility. This gene coding bHLH transcription factor, missing this gene will induce abnormal pollen and male sterility. In the present research, using Yeast one-hybrid technology, Chromatin immunoprecipitation- sequencing investigate the target genes which regulated by AMS transcription factor, combination with transcription sequence on different development stages of stamen on male sterility plants and male fertility plants, identify biological pathway which AMS transcription factor and its regulated target genes involved. Gene silencing and Arbidopsis trans-gene methods will be used for identify gene function. These research will help us to know how the AMS transcription factor regulate the stamen develop in DNA, RNA and protein level, net of AMS regulate the stamen develop, molecular mechanism of male sterility in melon will be identified.

甜瓜细胞核雄性不育具有育性稳定、配置组合自由的特点，对于育种工作具有重要的研究意义。本研究利用甜瓜细胞核雄性不育ms5 为材料，在前期对雄性不育基因精细定位的基础上，确定了花粉发育特异表达基因AMS(ABORTED MICROSPORES)为甜瓜细胞核雄性不育候选基因，该基因编码bHLH类转录因子，且该基因缺失后会导致花粉不能正常形成，最终导致雄性不育的发生。研究采用酵母单杂技术、染色质免疫共沉淀测序技术挖掘AMS 转录因子调控的关键靶基因，结合对雄性不育植株与可育株不同发育时期雄蕊的转录组测序分析，明确AMS 转录因子调控的关键基因及其参与的代谢途径；利用基因沉默技术及AMS 转化拟南芥ams 突变体鉴定基因功能，在DNA、RNA和蛋白质等水平上，系统的研究分析AMS在花药发育的过程中的主要作用、绘制AMS 转录因子调控花药发育的网络系统、明确甜瓜雄性不育的分子机理。

甜瓜细胞核雄性不育具有育性稳定、配置组合自由的特点，对于育种工作具有重要的研究意义。本研究利用甜瓜细胞核雄性不育ms5为材料，在前期对雄性不育基因精细定位的基础上，确定了花粉发育特异表达基因AMS(ABORTED MICROSPORES)为甜瓜细胞核雄性不育候选基因，对该基因启动子序列开展预测分析顺式作用元件，结果显示AMS 基因相关的顺式作用元件包括光响应元件、逆境相关的作用元件及激素响应相关元件。以AMS为靶基因开展酵母单杂实验，筛选到15个与AMS核心元件互作的蛋白，其中基因ID为LOC103496635的蛋白质含有锌带基序，表现出强阳性信号。经序列比较发现，该基因为一个与早期花粉发育有关的新基因，将这个基因命名为Cucumis melo L. zinc ribbon protein 1（CmZR1）。以CmZR1基因为靶基因结合酵母双杂筛选与其互作的蛋白，鉴定出31种与CmZRl相互作用的蛋白质，其中PME（Pectin Methylesterase，果胶甲酯酶）蛋白在所有筛选中中具有最高的转录因子活性概率，使利用点对点和GST pull down进一步确认了PME互作蛋白的可靠性，表明PME蛋白和CmZR1蛋白之间存在相互作关系。通过对雄性不育和可育株相关生理指标测定显示，雄蕊发育早期不育株果胶甲酯激酶活性显著低于可育株，在雄蕊长度为1mm~2mm 阶段为发育的转折点。结合对甜瓜雄性不育株及可育株不同发育时期转录组测序结果表明，CmZR1和PME基因均属于差异表达基因，二者协同调控AMS基因参与花粉壁形成的生物途径。以甜瓜可育系（FS5）为材料，利用CRISPR/Cas9基因剪辑技术获得了1株AMS功能缺失突变体。通过突变体和野生型植株的花粉活力鉴定对比，突变体花粉活力为野生型的30%，AMS功能缺失可以造成甜瓜花粉发育功能下降，是诱导雄性不育发生的重要基因。本研究采用酵母单、双杂技术、PULLdown 及RNA-seq 相结合分析甜瓜AMS 转录因子调控调控雄性不育的分子机制；利用基因剪辑技术验证了AMS在花药发育的过程中的主要作用，初步绘制了AMS转录因子调控花药发育的网络系统，结果为甜瓜雄性不育调控机制研究奠定分子基础，为甜瓜分子育种提供了理论依据。