矮牵牛转录因子PhDof4参与花药发育调控的分子机理研究

As the most important male reproductive organ, anthers can directly control the fertility of petunia. However, there is only a little reports about the molecular regulation mechanism of petunia anther development. In the previous study, according to the biological information analysis of 140 rice anther-specific genes’ promoters, the DOFCOREZM was identified as one of the common cis-elements, implying that the Dof transcription factor family members could play important regulation roles in the anthers. In our previous research, the tissue-specific expression patterns of 23 Dof transcription factor family genes were analysed in petunia. We found PhDof4 was an anther-preferential expressed gene and significant highly expressed in the anther tapetum degradation stage. Therefore, we plan to clarify the function of PhDof4 in anthers by transforming petunia 'W115', and then explore the up/down-stream genes of PhDof4 by transcriptome sequencing and yeast one-hybrid technologies, so that we can preliminary explain the expression regulation mechanism of PhDof4 during anther development, and provide new gene resources for creating petunia male-sterile lines.

花药是矮牵牛重要的生殖器官，对其育性有决定性作用，然而矮牵牛花药发育分子调控的机制至今仍鲜有报道。前人对140个水稻花药特异性表达基因启动子中的顺式调控元件进行了分析，发现DOFCOREZM为其中普遍存在的调控元件，暗示着Dof转录因子家族成员在花药发育过程中可能具有重要的作用。在前期研究中，我们对矮牵牛Dof转录因子家族中23个成员的组织特异性表达情况进行了鉴定，发现了一个在花药中优势表达的候选Dof基因PhDof4，而且其表达水平在花药绒毡层降解阶段具有显著提高的趋势。本研究拟先通过转化矮牵牛来确认PhDof4在花药发育过程中的功能，再通过转录组测序、酵母单杂交等技术，对PhDof4调控的下游基因以及其上游调控因子进行筛选，初步解析PhDof4在矮牵牛花药发育过程中的表达调控机理，并为矮牵牛雄性不育系的创造挖掘新的基因资源。

Dof转录因子是植物中特有的基因家族成员，对植物特有的生长发育过程往往具有重要的调控作用。花药作为矮牵牛的重要繁殖器官与花粉的育性密切相关。本人在前期对矮牵牛Dof基因家族成员进行了鉴定，发现PhDof4的表达模式与矮牵牛花药的发育进程呈现出一定的规律性，但是该基因的功能都尚未有明确的报道。本研究首先结合亚细胞定位和酵母自激活实验对PhDof4转录因子的基本特征进行了分析，发现该基因主要定位在细胞核和细胞膜，并具有较强的转录激活活性；然后构建了该基因的RNAi干涉载体，以矮牵牛W115为受体材料进行遗传转化，在PhDof4表达量显著降低的干涉株系中，我们发现矮牵牛的花药明显变小，且花粉的成活率和萌发率极低，具有雄性不育的表型；半薄切片分析发现，PhDof4::RNAi干涉株系在花药绒毡层形成时期和四分体时期发生了异常，花药不能为四分体细胞的分裂以及小孢子的正常发育提供充分的能量，进而导致雄性不育现象的产生；进一步的分析发现PhACO5、PhDFR以及PhGRP这3个与矮牵牛小孢子发育密切相关的雄性不育基因是PhDof4下游的调控序列，它们在PhDof4::RNAi株系中的表达都表现为显著的下降。以上结果表明PhDof4在矮牵牛花药发育过程中是不可缺少的关键调控基因。此外，本实验并未获得完全雄性不育的植株，这可能是PhDof4的表达在干涉株系中无法彻底关闭所导致。值得注意的是，我们也获得了超量表达PhDof4的矮牵牛植株，但是在超量表达株系中没有发现花药发育的异常，进一步的花粉成活率和萌发率实验也表明转基因矮牵牛的花粉育性并未受到影响。这很可能说明在矮牵牛花药发育进程中存在对过量的PhDof4自我清除的转录后调控机制。我们还构建了矮牵牛花药的酵母单杂交文库，并用PhDof4启动子作为钓饵进行了筛选，最终结合酵母点对点实验以及花药不同发育时期的转录组测序分析，我们获得了2调控PhDof4的MYB1和bHLH8转录因子，目前正在开展针对这两个基因的功能研究。本研究是对Dof转录因子具有调控植物花药发育功能的首次报道，有助于完善花药发育的调控网络，并为今后的雄性不育育种提供基因资源。