转录因子DYT1调控花药发育的信号网络研究

转录调控是植物花药正常发育的重要调控方式之一。转录因子DYT1是拟南芥花药绒毡层正常发育所必需的基因。本实验室前期的证据表明DYT1调节众多花药重要基因的转录水平。然而，揭开DYT1调节的庞大的基因网络，深度解析DYT1信号转导途径中新的组分，以及具体的调节机制还有待进一步深入研究。本研究拟运用microarray、SOLiD3.0深度测序、以及ChIP-Sequencing等技术，明确花药中受DYT1调节的转录调控网络，找到新的调节花药发育的基因；应用突变体及相关生化试验，探索DYT1调节下游基因表达的分子机制；通过Y-2H库、Co-IP、质谱等手段筛选DYT1途径的结合蛋白；通过生化和遗传手段对调节DYT1活性的上游基因进行初步探索。本研究将进一步揭开花药发育调控的庞大的信号网络及调节机制，为通过遗传方法改良作物育性提高产量提供理论支持。

转录调控是植物生殖发育的重要调控方式之一。转录因子 DYT1 是拟南芥花药绒毡层正常发育所必需的基因。前期microarray实验数据表明在dyt1-1的突变体中，花药基因的表达量呈两倍以上的变化。然而,揭开 DYT1调节的庞大的基因网络,深度解析 DYT1信号转导途径中新的组分,以及具体的调节机制还有待进一步深入研究。而这些研究对于进一步揭开花药发育调控的庞大的信号网络及调节机制、对于通过遗传方法改良作物育性提高产量具有重要的理论指导意义。本项目以此为出发点，首先利用二代测序所得数据分析了dyt1-3突变体中表达变化的基因，找到了一大批受DYT1调节的下游基因，为揭开其调控网络奠定基础；同时，利用酵母双杂交和荧光互补实验筛选并验证了大批和DYT1相互作用的蛋白，包括转录因子、激酶、磷酸酶、代谢酶类等。在这两类发现的基因中，有三个基因bHLH10，89，91同时表达受到DYT1的调控又和DYT1相互作用，因而作为本项目的研究重点。研究发现，这三个基因在花药的6-9期的绒毡层和小孢子中表达，其单突变均没有明显的表型，但是分别两两杂交得到的双突变具有明显的花粉败育的现象，暗示三个基因间可能存在功能冗余。花药半薄切片结果显示双突变体的花药绒毡层发育异常，液泡化现象严重，并发小孢子败育。生物信息和分子进化分析显示，这三个基因为相同祖先基因在十字花科植物中发生的串联重复，进一步证实三个基因为功能冗余基因。分别收集bhlh10-2(CS405270)、bhlh89(CS425178)和bhlh91 (SALK_091867)突变体4-7期的花药，进行转录组分析，发现这三个基因的突变体虽然没有育性的异常，但是转录组水平已经发生变化，并且共同调节268个基因的表达，再一次表明三个基因可能存在功能冗余。与dyt1-3的转录组数据进行比对分析，发现133个基因在四个基因的单突变体中均有2倍以上的表达变化，暗示这三个bHLH转录因子可能通过调节这些DYT1下游基因的表达而在花药发育过程中发挥重要功能。综上所述，本项目通过蛋白筛选、高通量测序、分子遗传、细胞生物学等多方面的证据，找到了一大批DYT1相互作用蛋白以及受DYT1调节的下游基因；发现了三个既和DYT1相互作用、又和DYT1相互调节表达的、bHLH家族成员存在功能冗余，并且通过调节DYT1的下游基因而调控花药的正常发育过程.