弯曲菌外排泵变异体RE-CmeABC功能增强的分子机制

The emergence and spread of multidrug resistant Campylobacter, a major zoonotic pathogen, pose a critical challenge to clinical anti-infection treatment. The efflux pump CmeABC is an important mechanism conferring multidrug resistance in Campylobacter. In the previous study, we reported a variant of CmeABC (RE-CmeABC) in Campylobacter of livestock and poultry origin. Furthermore, RE-CmeABC exhibited enhanced function on efflux of antibiotics, conferring multiple antibiotics resistance and promoting the emergence of antibiotic-resistant mutants compared to wild-type efflux pump CmeABC, while the molecular mechanism remains unclear. This project intends to confirm the key domain and amino acids of potent RE-CmeABC by mutant construction, antimicrobial susceptibility testing, accumulation assay, and frequencies of emergence of fluoroquinolone resistant mutants, drug binding target analysis, reverse mutation and molecular dynamics simulation. This result will provide insights for design of new multidrug efflux pump inhibitor.

多重耐药弯曲菌作为重要的人畜共患病原菌，其出现和传播给食品安全和公共卫生带来巨大挑战，外排泵CmeABC是弯曲菌多重耐药的主要机制。申请人前期在畜禽源弯曲菌中发现了功能增强型外排泵变异体RE-CmeABC，与野生型外排泵CmeABC相比，该变异体在外排药物、介导耐药种类与耐药水平、促进菌株耐药突变发生等多个方面的功能显著增强，但其分子机制尚不清楚。本项目拟通过突变体构建、药敏试验、药物外排能力和氟喹诺酮类耐药突变频率测定，确定RE-CmeABC功能增强的关键结构域；通过药物结合靶点分析，预测关键突变氨基酸位点；通过回复突变、药物外排能力测定、分子动力学模拟等进行确证。本项目有望揭示RE-CmeABC功能增强的关键结构域及氨基酸位点，为新型多重耐药外排泵抑制剂设计提供思路。

弯曲菌是一种重要的人兽共患病原菌，多重耐药菌株的出现和传播给食品安全和公共卫生带来巨大挑战，外排泵CmeABC是弯曲菌多种耐药的主要机制。本项目前期发现功能增强型外排泵变异体RE-CmeABC，该变异体在外排药物、介导耐药种类与耐药水平等多个方面的功能均显著强于野生型外排泵CmeABC。本项目以此为切入点，围绕弯曲菌外排泵变异体RE-CmeABC功能增强的分子机制，预测了关键结构域和氨基酸，并通过定点突变构建了回复突变菌株进行验证；同时揭示了RE-CmeABC在全球范围的分布特征；在执行项目过程中发现新型外排泵变异体；为控制弯曲菌耐药性提供科学论据。.项目重要结论如下：1、解析了氟苯尼考、红霉素、环丙沙星三种药物的外排通道，对关键结构域和氨基酸进行了预测，通过定点突变对关键氨基酸进行功能验证，相关实验成果已整理成论文初稿，准备投稿阶段。2、发现RE-cmeABC已经广泛在世界范围流行（超过10个国家）；MLST分析发现多种ST型与RE-cmeABC的传播有关，ST2109是最主要的ST型；系统发育进化关系表明人源弯曲菌与肉鸡源弯曲菌亲缘关系较近。3、在执行本项目的过程中，发现弯曲菌对四环素类特异性新型外排泵变异体—Tet(L)变异体，该变异体可导致弯曲菌对四环素类药物高水平耐药；该变异体还可介导大肠杆菌对替加环素敏感性大幅度降低；该泵变异体位于菌株染色体的多药耐药基因岛，具有潜在传播的风险。