单增李斯特菌适配体的结构分析及适配体磁性微球传感器检测方法的建立

Listeria monocytogenes are important foodborne pathogens。The mortality is more than 20% .So the rapid detection of Listeria monocytogenes and its biomarkers in food is an important measure to protect food safety. This study would synthesis a random single-stranded oligonucleotide (ssDNA) library, which were 78base pairs and containing 40 random sequences.The exponential enrichment ligand phylogenetic screened aptamers. The secondary structure was determined by lead cleavage and dimethylsurfate modificationg.This provided a reference for screening new ligand.Aptamers were labeled with avidin as the capture chain, connected with the streptomycin-labeled magnetic beads. A complementary strand was labelled with cy3 as detecting signal. This was a aptamer sensor based on magnetic microspheres. The sensor reacted with different concentrations of Listeria monocytogenes, in order to establish the quantitative relationship between the hly concentration and fluorescence intensity of Listeria monocytogenes to achieve the purpose of rapid and quantitative detection of foodborne pathogens.

单增李斯特菌是威胁人类健康的重要食源性病原菌，死亡率高达20%以上，对食品中单增李斯特菌及其生物标志物的快速检测是保障食品安全的重要措施。本研究拟合成一个全长78bp中间含40个随机序列的随机单链寡核苷酸（ssDNA）文库，采用指数富集配体系统进化技术筛选单增李斯特菌的适配体，以Pb2+的竞争性剪切和硫酸二甲酯标记等方法探索适配体二级结构及与功能的关联性，为新型配体的获得提供技术借鉴。亲和素标记适配体作为捕获链，同链霉素亲和素标记的纳米磁性微球相连，同时合成侧翼与捕获链互补的ssDNA并标记荧光素cy3作为显色链，组装磁性微球适配体传感器。与不同浓度的单增李斯特菌发生反应，建立李斯特菌数量与荧光强度之间的关系，实现食品中单增李斯特菌快速和定量检测。

单增李斯特菌在环境中广泛存在，可以通过多种途径污染食品，同时它具有嗜冷特性，可以在冷藏条件下生长繁殖，是冷藏食品污染的重要病原菌。因此检测方法是保障食品安全，避免食源性疾病发生的必要措施。本研究的目的是获得单增李斯特菌的一种新型检测配体---适配体，并应用于开发单增李斯特菌快速检测方法。首先制备了核壳型聚苯乙烯/丙烯酰胺Fe3O4磁性微球，并采用共价结合法连接链霉亲和素，该磁性微球可以特异性结合生物素化的ssDNA，在SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)过程中用于回收适配体，在开发单增李斯特菌检测方法时用于捕获单增李斯特菌。采用指数富集配体系统筛选得到单增李斯特菌适配体群，选用亲和力较强的2条适配体组合，建立了夹心酶联配体检测方法（enzyme linked aptamer absorbent assay, ELASA）。对人工污染的牛奶样品进行检测，结果显示该方法能够特异性地检测单增李斯特菌。该检测方法在湖北省两个公司进行试用，结果显示与国标法比较没有假阴性，假阳性结果小于10%。为了开发更多样的检测方法以适应不同需求，本研究利用适配体磁性微球捕获单增李斯特菌，选取iap基因具有属特异性的片段和hly基因具有种特异性的片段作为检测的靶基因开发多重PCR检测方法。为了弥补一些检测方法不能区分死细胞和活细胞的缺点，加入PMA(propidium monoazide)选择性地抑制死细胞DNA的扩增，有效地检测活细胞。本研究通过筛选得到的适配体可以特异性地识别单增李斯特菌，广泛应用于单增李斯特菌检测相关研究。建立的ELASA 和多重PCR检测方法操作简便，省时省力，更适合快速检测的需求，在保障食品安全方面具有重要意义。