迟缓爱德华氏菌V型分泌系统的分析研究

Edwardsiella tarda is currently one of the most important fish pathogens that affects the aquaculture industries worldwide. The pathogen infects of many kinds fish, which leads to serious economic losses in the aquaculture in china. To date, Infection process and pathogenic mechanism of E. tarda are not yet fully understood. The type V secretion system (T5SS), also called autotransporters, are a large family of secreted proteins found in Gram-negative bacteria and are typically involved in virulence, such as displaying enzymatic activity, mediating host invasion, acting adhesins, and producing cytotoxins. T5SS has been considered to be one of important virulence factors of Gram-negative pathogens. However, the function and mechanism of T5SS in E. tarda is unknown. In this study, we will analyze the functional activity and expression and regulation characteristics of T5SS in E. tarda, using bioinformatics, enzymatic assays and molecular biological methods such as gene mutation, real-time fluorescent quantitative PCR and immunoblotting. On the other hand, by means of construction of T5SS gene mutated strain and over-expression of T5SS gene, we will analyze and study the T5SS's function in the biofilm formation, antiserum formation and infection capacity to host. The project will determine and clarify T5SS's pathogenic mechanisms and the role in the pathogenic process of E. tarda, which will be the first study of T5SS in E. tarda.

迟缓爱德华氏菌是一种危害严重的水生生物病原菌，每年给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失,目前该病原菌的侵染过程、致病机理在很大程度上仍不清楚。Ⅴ型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中，它能向胞外分泌活性酶、粘附素、细胞毒素和免疫调节蛋白等物质，是革兰氏阴性致病菌的一个重要毒力因子，存在于迟缓爱德华氏菌中，但其功能未知。基于此，本项目拟从迟缓爱德华氏菌Ⅴ型分泌系统入手，综合使用生物信息学、基因突变、酶活测定、荧光定量PCR、免疫杂交等方法，研究该系统的功能活性，分析其表达调控特征；同时，构建Ⅴ型分泌系统基因突变株和过量表达株，分析比较野生株、突变株与过量表达株在细菌生物膜的形成、抗血清以及对牙鲆侵染能力等方面的差异，确定Ⅴ型分泌系统在迟缓爱德华氏菌致病过程中的作用，阐明该系统的致病机制。本研究的成功将填补迟缓爱德华氏菌Ⅴ型分泌系统研究领域的空白，为迟缓爱德华氏菌病的防治提供理论基础。

迟缓爱德华氏菌是一种危害严重的水生生物病原菌，每年给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失，但其致病机理在很大程度上仍不清楚。Ⅴ型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中，是革兰氏阴性致病菌的一个重要毒力因子，存在于迟缓爱德华氏菌中，但其功能未知。本项目的主要研究内容包括迟缓爱德华氏菌Ⅴ型分泌系统载客蛋白酶的生物学功能分析、表达与调控研究、与细菌致病性的关系分析等。.项目分析了迟缓爱德华氏菌Ⅴ型分泌系统（TshEt）序列特征，发现tshEt编码1224个氨基酸的蛋白（TshEt），TshEt具有信号肽、载客功能域和自主转运结构域等三个结构域，其中载客功能域包含了一个S6 Pfam域的肽酶（PepS），PepS具有丝氨酸蛋白酶的保守基序。项目检测了tshEt在不同条件下的表达情况，发现 tshEt在高温、高PH值、铁缺乏以及侵染宿主时诱导表达；构建了tshEt的突变株（TX01△tsh）并分析了其致病性，实验结果表明，与野生株TX01相比，突变株TX01△tsh形成生物膜的能力和抗血清杀菌能力显著下降， TX01△tsh阻碍宿主免疫应答能力降低，侵染宿主组织的能力显著降低，TX01△tsh整体毒力显著降低。为了明确TX01△tsh的毒力效应是否由tshEt的失活引起的，我们构建了突变株TX01△tsh的互补菌株TX01△tshC，毒力实验表明，与TX01△tsh不同，TX01△tshC的对宿主的组织侵染能力和对宿主的致死能力与野生型TX01相当。体外表达和纯化了重组PepS（rPepS），发现rPepS具有丝氨酸蛋白酶活性，rPepS作为亚单位疫苗具有较好的免疫保护效应。本项目还筛选到3个对tshEt启动子具有明显调控作用的蛋白。本研究系首次在鱼类致病菌中研究温度敏感性血凝素Tsh并发现其是迟缓爱德华氏菌一个多效性的毒力因子。项目研究结果填补了迟缓爱德华氏菌Ⅴ型分泌系统研究领域的空白，并有助于迟缓爱德华氏菌致病机制的进一步阐明；此外，本项目构建的亚单位疫苗rPepS将有助于迟缓爱德华氏菌病的防治。