绵羊PLCγ1基因通过RTK信号通路调控绵羊早期胚胎发育分子机制研究

It has been proved that Phospholipase C-gamma 1 (Phospholipase C- gamma 1) has regulatory effect on embryonic development of mice and zephyr fish, and is activated by tyrosine kinase (RTK) Receptor, but the transmission mechanism of plc-1 in the RTK signaling pathway is not clear, and the related signaling pathways and interactions are not yet reported in sheep. The objective of the research idea is: first, by interfering with PLC - gamma 1 signaling pathways and keep other dependence RTK signaling pathways, RTK in each stage of embryonic development and its signal through the expression level of the key factors in its action; Second, through the PLC - gamma 1 into mature oocytes, research by PLC of the RTK mediated - gamma 1 play a role in the process of germ cell proliferation. Three different, through the analysis of PLC gamma 1 gene expression levels of regulation, the study of RTK signal transduction pathway in the process of embryonic development key factor phosphorylation PLC - gamma 1 and intracellular Ca2 + release process, and thus reveals the PLC gamma 1 sheep sheep gene regulation through RTK signaling pathways provide certain scientific basis for early embryonic development of molecular mechanism.

已证明磷酸脂酶C-γ1（Phospholipase C-γ1，PLCγ1）对小鼠和斑马鱼的胚胎发育具有调控作用，并被酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase，RTK）受体激活，但PLC-γ1在RTK信号通路中的传递机制并不清楚，其中涉及的相关信号通路及相互作用在绵羊方面尚未见到相关报道。本项目的研究思路是：一、通过干扰PLC-γ1信号通路而保持其它RTK依赖性信号通路，检测胚胎发育各阶段中RTK及其信号通中关键因子的表达水平与其作用；二、通过将PLC-γ1注入成熟卵母细胞中，研究由RTK介导的PLC-γ1在胚细胞增殖过程中所起到的作用；三、通过分析PLCγ1基因不同表达水平调控下，研究胚胎发育过程中RTK信号调控通路关键因子磷酸化PLC-γ1和细胞内Ca2+释放过程，从而揭示了绵羊PLCγ1基因通过RTK信号通路调控绵羊早期胚胎发育分子机制提供一定的科学依据。

1.成功克隆绵羊PLC-γ1基因，其分子量为3870 bp，具有高度保守结构域、超家族结构域和EF-PI-PLC手区域超家族、特异性结构域PI-PLCc-GDPD-S、PLCYc核心结构域。为研究PLC-γ1在绵羊早期胚胎发育细胞定位提供基础。.2.成功构建pDsRed2-C1-P2A-3Flag-PLC-γ1真核表达（红色荧光）载体，细胞中表达量很低，可用于细胞定位。同时也构建了shRNA慢病毒干扰载体。为探究PLC-γ1在细胞上下游信号通路中相关蛋白定位奠定基础。.3.重新构建了pcDNA3.1-EGFP-PLCγ1真核过表达（绿色荧光）载体，并将其显微注射到绵羊MⅡ期卵母细胞胞质中，可引起卵母细胞Ca2+波动，并导致其激活、卵裂，表明PLC-γ基因对绵羊卵母细胞具有激活作用。.4.通过实验也证明，PLC抑制剂和激活剂可显著改变PLC-γ1蛋白表达量，表明PLC-γ1在绵羊卵母细胞的体外成熟培养中发挥重要作用，其可调节卵母细胞的成熟能力。.5.在胚胎发育各时期检测PLCγ1可刺激胚胎发育各时期Ca2+波动，表明，PLCγ1通过调控Ca2+波动来影响早期胚胎发育。.6.胚胎各时期检测AKT、PKC和MAPK基因mRNA及蛋白的表达量呈上升趋势，说明PLCγ1通过调控RTK下游信号通路中AKT、PKC和MAPK基因表达来影响绵羊早期胚胎的发育。.7.Western-blot检测显示，胚胎发育各时期PI3K、P-AKT、P-mTOR蛋白表达显著上升时，胚胎发育力得到增强。表明，PLC-γ1通过调控胚胎发育各阶段中RTK及其信号通中关键因子的表达来促进胚胎细胞的增殖过程。.8.PLC-γ1对各时期早期胚胎细胞超微结构的变化产生影响来促进早期胚胎的发育。.9.利用RT-qPCR分析胚胎发育的各时期抗凋亡基因时发现，胚胎发育各时期抗凋亡基因表达水平呈升高趋势，表明，PLCγ1促进胚胎发育的同时可抑制凋亡基因mRNA水平，从而对胚胎发育过程起到促进作用。.10.颗粒细胞中PLCγ1分布于细胞核和细胞质中，且主要在细胞质内，推测颗粒细胞PLCγ1在刺激卵母细胞成熟的同时，有可能也刺激对卵母细胞外面的颗粒细胞发育，最终协助卵母母细胞的体外成熟。.课题组，已发表论文5篇，在投论文3篇，今后2年内发表论文1-2篇。培养硕士研究生3名，后续还有一名正在进行后续延伸内容，达到了预期目标