绵羊精子提取液中PLCζ对绵羊卵母细胞胞质钙振荡和早期胚胎发育的影响

卵子被激活机理的研究中磷脂酶C-zeta"(Phospholipase C zeta, PLCζ)对胞质钙离子振荡的研究是个热门课题。因此，PLCζ有着无穷的研究潜力和广阔的应用前景。本项目研究思路一是将绵羊精子提取液中的PLCζ分离纯化后注入卵母细胞中，检测卵母细胞钙离子振荡启动的作用；二是克隆PLCζ基因并构建真核表达载体后注入卵母细胞中，检测PLCζ在卵细胞中的表达水平和其空间分布并通过在PLCζ上结合的荧光蛋白检测钙离子波动启动与终止与PLCζ的关系，检测其在早期胚胎发育时期表达以及对细胞增殖的作用。采用SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定PLCζ纯化和表达情况，采用EPICS ELITE ESP型流式细胞仪测定钙离子振荡特点，为揭示PLCζ介导的细胞内钙库释放的特异信号传导通路和卵母细胞孤雌激活机理或受精机理提供一定的科学依据。

本课题取得了以下研究成果：.1.Genbank中发表的磷脂酶C zeta（PLC ζ）基因序列设计引物，扩增PLC ζ基因。测序结果表明，基因开放阅读框全长1905 bp，共编码634个氨基酸。绵羊PLC ζ基因具有典型的 EF-hand 钙结合结构域、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶X结构域、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶Y结构域、蛋白激酶C2保守区域，其170和215氨基酸位点为组氨酸活性位点活性位点。.2.真核绿色荧光表达载体pEGFP-N1，将PLCζ克隆至增强型绿色荧光蛋白EGFP基因上游，成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-PLCζ。通过脂质体转染pEGFP-N1- PLCζ载体瞬时转入293T细胞以及绵羊胎儿成纤维细胞，鉴定其表达效率。在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下成功观察到重组质粒在细胞中的表达和分布。 3.用PCR方法扩增基因的编码序列，两端分别加上相应的酶切位点，亚克隆到原核表达载体pCzn1中，导入Arctic Express TM (DE3)感受态细胞，IPTG诱导表达，收样后检验PLCζ的表达情况。用镍离子亲和层析的方法大量纯化融合蛋白。表达纯化后可获得了分子量约74kDa的融合蛋白,符合预期大小。 4.用PCR技术扩增出PLCζ基因片段，设计引物XH41和BH41，双酶切含有PLCζ的克隆载体和DsRed表达载体和Pvnus表达载体，获得真核表达载体DsRed-PLCζ和Pvnus-PLCζ。 5.通过显微注射将pEGFP-N1-PLCζ重组质粒注入绵羊卵母细胞内表达，利用荧光显微镜成功检测到pEGFP-N1-PLCζ在卵母细胞中表达，激活了绵羊卵母细胞，使其发育至囊胚。.6.通过激光共聚焦显微镜扫描卵母细胞及早期胚胎发育过程中有钙振荡现象，并利用相关软件分析钙离子波动启动和终止与PLCζ的关系，检测到在早期胚胎发育时期表达以及对细胞增殖的作用。.7.用PCR技术扩增出PLCζ基因片段，设计引物以BspEI和SalI 酶切位点，获得获得慢病毒表达质粒pRRL-CMV-plcζ，以备PLCζ的蛋白纯化。. 以上研究成果提示：绵羊PLCζ基因可以激活绵羊卵母细胞，引起Ca2+振荡和可促进早期胚胎的发育。课题组，共发表论文4篇，在投论文2篇，今后2年内发表论文1-3篇。培养硕士研究生3名，基本达到了预期目标。