PIN蛋白家族差异调控草莓匍匐茎不定根形成的机制研究

Adventitious root (AR) formation belongs to a part of postembryonic organogenesis in higher plant, which plays an important role during strawberry asexual reproduction. Unfortunately, all the cultivars of strawberry have no ability to forming AR in their odd internodes of stolon, thus the efficient of asexual reproduction was limited. Polar auxin transport controls multiple plant organs morphogenesis including the adventitious root formation. PIN family as the key carriers of polar auxin transport, which determine the direction of axuin efflux. Since the odd internodes of stolon in strawberry Fragaria viridis has the ability to form AR spontaneously (except the first internode), whereas the Fragaria vesca cannot, the wild diploid strawberry of Fragaria viridis and Fragaria vesca are used as the comparative materials in this program. Firstly, we try to use immunolocalization to examine the PIN family localization on their cell membrane during AR formation originated from strawberry stolons, at the same time all the members of PIN genes expression and auxin content determination in different phases of AR formation will be done. Then the key PIN protein in regulating strawberry stolon AR formation can be determined according to comprehensive analysis of above results. Secondly, we try to use the transgenic method to reveal the function of PIN proteins in differential regulating AR formation of strawberry stolon among various species. At last, we dedicate to provide a theoretical basis for strawberry asexual reproduction and further promoting the production of cutting propagation in fruit tree or woody ornamental plants.

不定根属于高等植物特有的一类胚后器官，其在草莓无性繁殖的匍匐茎繁苗生产中扮演着重要的角色，而栽培种草莓匍匐茎的奇数节没有形成不定根的能力，限制了草莓的繁苗生产。生长素极性运输控制着包括不定根在内的多种器官形态建成。PIN蛋白家族作为生长素极性运输的关键载体，在细胞膜上的定位决定了生长素的运输方向。本项目拟选用匍匐茎的奇数节具有自发形成不定根能力的野生种绿色草莓和奇数节没有不定根形成能力的野生种森林草莓为试材。首先利用免疫组化方法，检测PIN蛋白家族在两种试材匍匐茎不定根形成过程中的膜定位情况，同时分析PIN基因家族的表达模式和生长素的阶段性作用。综合分析后，明确调控草莓匍匐茎不定根发生的关键PIN蛋白。最后利用遗传转化手段对PIN蛋白家族差异调控不同种草莓匍匐茎不定根形成的功能进行验证。以期为草莓无性繁殖提供直接的理论依据，推动以不定根发生为主的果树及园林植物的扦插繁殖。

利用匍匐茎繁育子苗是保障草莓生产的重要环节。草莓匍匐茎第一节芽保持休眠，而第二节芽既可形成子苗，又可形成新一级的匍匐茎。针对第一节芽为何保持休眠，且匍匐茎异质性芽发育过程及其调控机制如何，一直是悬而未决的科学问题。基于此，本项目的实施以开展草莓匍匐茎异质性芽的表观观察为切入点，系统性地对栽培草莓‘宁玉’匍匐茎第一节和第二节上着生的芽和不定根进行生理及基因层面的解释观察，以确定关键发育时期。利用全蛋白组学定量分析方法，挖掘了草莓匍匐茎芽异质性的关键调控蛋白。最后，应用內源验证（PRM分析）所挖掘的关键蛋白在各类型芽中的表达模式及作用机制。重要研究结果体现在以下几个方面：一是确定了第一节休眠枝芽关键的休眠节点是分化2-3片苞叶后，最内层苞叶形成紧闭结构，此时已经分化的休眠枝芽生长点进入休眠态。而第二节可成苗的根本是匍匐茎顶端枝芽逐渐退化成簇状的叶芽，行使三出复叶功能；并在其旁侧形成新的匍匐茎枝芽（下一级的匍匐茎），两者同时发育；而后在簇状叶芽发育的刺激下，在匍匐茎第二节顶端形成层分化出不定根原基，最终形成独立的子苗。二是基本确定栽培草莓匍匐茎第一节枝芽保持休眠的部分原因为顶端优势导致的抑制休眠作用所致。三是确定了调控草莓匍匐茎芽呈现异质性的关键蛋白，如剪接体类因子，可能是转录水平差异对第一节和第二节枝芽的休眠/活动态起关键调控作用；DNA水平的特异蛋白，可能对第一节匍匐茎枝芽的形成和第二节匍匐茎枝芽退化形成子苗叶芽起关键调控作用；苯丙烷类物质合成相关蛋白，主要调控同位于第二节上的子苗叶芽和活动型枝芽的分化发育。四是通过内源蛋白质定量分析方法（PRM）分析并验证了关键差异调控蛋白。本研究的结果丰富了解析“栽培草莓无性繁殖过程中，其匍匐茎第一节上的芽通常保持休眠，而第二节上的芽既成苗又可继续抽生新匍匐茎”的理论基础。为后来人继续开展揭示关键蛋白质调控草莓匍匐茎芽异质性的作用机制打下了坚实基础。