新型氟化聚（β-氨基酯）基因载体的构建及其在隐性营养不良型大疱性表皮松解症基因递送中的机制研究

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is a severe hereditary bullous disease, which is caused by the mutation of COL7A1 gene. Gene therapy is considered one of the most promising approach in the treatment of RDEB. Development of a safe and efficient non-viral gene vector is a determining factor for gene delivery. Our previous work has shown that the gene delivery performance of poly(β-amino ester)s (PAEs) can be enhanced by introducing the branching strategy. However, the delivery capacity of COL7A1 in the previous system is still limited. Herein, this project is proposed for developing a novel fluorinated PAE (FPAE) as a new generation gene vector for the gene delivery in RDEB. The fluorination strategy will be performed through fluorination modifications of numerous PAEs with diverse chemical structures and functional groups. It is hypothesized that the newly developed FPAE can improve some crucial properties of the vector/COL7A1 complex such as cellular uptake, endosomal escape and biocompatibility in gene delivery, and thus promote gene transfection efficiency and cell viability in RDEB skin cells. In addition, the delivery potency of COL7A1 and preliminary safety profile of the treatment will be evaluated in a human RDEB skin equivalent graft murine model. This project is aiming to develop an outstanding platform of fluorinated gene vectors for RDEB treatment. Understanding the role of fluorination strategy of gene vectors in COL7A1 gene delivery would shed substantial light on developing new technologies and methods required for RDEB treatment in a clinical setting.

隐性营养不良型大疱性表皮松解症（RDEB）是一种严重的遗传性大疱病，因COL7A1基因突变引起。基因治疗是RDEB最具前景的疗法之一，构建安全有效的非病毒基因载体用于基因递送是极其关键的环节。我们前期研究表明，聚（β-氨基酯）（PAE）载体可通过支化策略提升性能，但对COL7A1的递送效能仍然有限。在此，本项目拟开发新型的氟化PAE（FPAE）载体并首次用于RDEB中的基因递送。通过对具有不同化学结构和功能基团的PAE进行氟化修饰，以提升基因递送中载体/COL7A1复合物的细胞内吞、内涵体逃逸和生物相容性等关键性能，最终提高其在RDEB皮肤细胞中的基因转染效率和细胞活力，并以人RDEB组织工程皮肤移植小鼠模型评价其COL7A1的递送效能和治疗安全性。本研究拟搭建优异的氟化基因载体平台，阐明氟化策略在COL7A1基因递送中的作用机制，对研发RDEB临床亟需的新技术疗法具有积极的开拓性意义。

背景：隐性营养不良型大疱性表皮松解症（recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB)因COL7A1突变引起，临床上尚无治愈方法，基因治疗是最具前景的方法之一。其中，非病毒基因载体应用潜力巨大。.研究内容：1）构建新型氟化聚（β-氨基酯）（fluorinated poly(β-amino ester), FPAE）基因载体；2）开展FPAE 载体在体外细胞实验中的筛选和优化；3）进行优异FPAE的理化性能及其克服细胞内基因递送屏障研究；4）开展载体在小鼠中的体内评价；5）对少见亚型的DEB开展诊断性研究。.重要结果：1）FPAEs的构建采用二丙烯酸酯、小分子胺与含氟单体通过“A2+B2+C2”迈克尔加成反应进行合成，其中，优异的FC32-E7和FC32-E5载体被筛选出；2）FC32-E7在HeLa细胞中介导了高于C32、jetPEI和LipoFectamine 3000的基因转染效率，并无明显细胞毒性，其在难转染性原代RDEBF细胞中介导了优异的基因递送表现，能有效地递送COL7A1逆转疾病表型；FC32-E5在HEGP2和Jurkat细胞中介导了显著高于LipoFectamine 3000的基因转染效率；3）FPAE与DNA形成带正电荷的、椭圆形的球形纳米粒子，氟化策略有效提升其细胞内吞和内涵体逃逸效率；4）FPAE/COL7A1复合物在Balb/c 小鼠体内成功介导了重组人型VII型胶原蛋白在基底膜带的表达；5）经临床表现、皮肤组织病理、VII型胶原免疫荧光、基因测序明确诊断一例痒疹型DEB，该患者检测出COL7A1:NC_000003.12(NM_000094.4):c.6181-17C>G突变，该突变位点既往未曾被报道。.关键数据：氟化策略可提升载体的基因递送效能，实现COL7A1的强效递送，并能在难转染细胞中产生优异的基因递送效能。.科学意义：1） 搭建新型氟化 FPAE 平台，探索和阐述氟化策略在基因转染中的作用机制，对构建新型的非病毒载体和开发商业化基因转染试剂具有重要的借鉴意义；2）开发新型的聚合物基因载体用于RDEB 的基因递送和治疗，对研发 RDEB 临床亟需的新技术疗法有重要的推动意义；3）本研究中载体的设计、应用和生物学功能评价，为其他单基因疾病基因治疗的发展带来重要参考。