调节猫体细胞重编程的小分子化合物筛选及其作用机制的研究

iPS are adult cells that have been genetically reprogrammed to an embryonic stem cell-like state by defined transcription factors. The cat is one of the important animal model to study human disease, so it is important to establish the cat iPS. However, we know little about the regulatory mechanism of the cat somatic cell reprogramming. Studies show that small molecular compounds plays important roles in the regulation of cell reprogramming.We also know that cell reprogramming is associated with DNA methylation and histone acetylation. In previous studies, we have established the cat embryonic stem-like cell lines, cloned the cat-specific pluripotent transcription factors. We also found that some of the small molecular compounds plays important roles in the cat embryonic stem-like cell pluripotency. On the basis of preliminary studies, the project will import cat-specific transcription factors into the somatic cells by constructing viral vectors then reprogram the cells. The small molecule compounds effects on DNA methylation and histone acetylation will be anlyzed.Combined with expression rate of alkaline phosphate(AP), this program will screen the small molecular compounds which is important to the cat somatic cell reprogramming. The regulatory mechanism will be researched. This study will provide a theoretical basis for understanding molecular mechanism of cat somatic cell reprogramming.

诱导多能干细胞(iPS)是由特定转录因子对体细胞重新编程而获得的，具有胚胎干细胞特性的多能干细胞。猫作为研究人类疾病的重要模型动物之一，建立猫的iPS具有非常重要的意义。然而，我们对猫体细胞重编程的调控机制却知之甚少。研究表明，小分子化合物对细胞的重编程起着重要的调节作用，而细胞的重编程又与DNA的甲基化和组蛋白的乙酰化密切相关。在前期研究中，我们建立了猫类胚胎干细胞系、克隆了猫特异性转录因子,并发现了某些小分子化合物对猫类胚胎干细胞的多能性起非常重要的调节作用。本项目拟在前期研究的基础上，通过构建病毒载体将猫特异性转录因子导入到猫体细胞中，使其重新编程；分析这些小分子化合物在猫体细胞重编程中对DNA甲基化和组蛋白乙酰化的影响，再结合碱性磷酸酶（AP）阳性表达率，筛选出对猫体细胞重编程具有重要调控作用的小分子化合物，并探讨其调控机制。本研究将为阐明猫体细胞重编程的分子机制提供理论依据。

猫是研究人类疾病的重要的模型动物之一，因此建立猫的诱导多能干细胞（iPS）具有重要的意义。课题组前期已成功建立了猫的类胚胎干细胞系（ES-like cells），并克隆了猫多能性基因POU5F1, NANOG，SOX2，KLF4，LIN28，c-Myc。本课题在前期研究的基础上，首先将目的基因(Oct4，SOX2，KLF4，c-Myc)与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体LV5进行定向连接，构建慢病毒表达载体LV-Oct4、LV-Sox2、LV-KLF4和LV-cMyc，将其连接产物分别转化至细菌感受态细胞中，经筛选阳性克隆、酶切鉴定后测序，通过Lipofectamine2000介导转染293T细胞对慢病毒进行包装并测定病毒滴度, 经过双酶切鉴定及测序分析，表明成功构建并包装出了LV-Oct4、LV-Sox2、LV-KLF4和LV-cMyc慢病毒载体，基因测序结果与目标序列完全一致，且病毒滴度均达到107TU/ml以上。其次，我们将已构建的重组慢病毒感染到猫的成纤维细胞，成功诱导出了猫iPS,并对其进行了鉴定。另外，我们还发现小分子化合物VPA对猫iPS的诱导具有显著的促进作用，为了探讨VPA对microRNA和多能性转录因子的影响，我们首先用MTT法确定VPA的浓度梯度，采用流式细胞术检测VPA对3T3细胞周期的阻滞情况，同时观察细胞形态的变化，并用荧光定量PCR法检测 Oct4和Sox2以及miR-367表达量的变化。结果显示，VPA剂量依赖性地抑制3T3细胞的增殖，且随着浓度的升高抑制作用增强，并将细胞周期阻滞在G2/M期。此外，VPA能使Oct4和miR-367的表达量增加。这表明VPA在体细胞重编程中可能介导多能性转录因子Oct4和miR-367的表达来促进重编程效率。