小分子化合物对体细胞核移植重编程作用机制的研究

通过体细胞核移植（SCNT）获得克隆动物为良种公畜的扩繁、农业动物优良经济性状的引入或者改良以及再生医学的细胞治疗提供了很大的希望和无限的可能。但由于体细胞重编程不完全和机制不明导致的克隆效率低下以及克隆动物异常是限制了体细胞核移植的应用。iPS的出现发展了一条崭新的对体细胞进行重编程的途径。通过iPS或SCNT进行体细胞重编程既有联系又有区别，可相互借鉴和促进。目前有多项研究成果标明通过小分子化合物的应用可以改善iPS细胞的重编程效率和质量。本研究将探讨利用能够有效改善和提高iPS重编程效率的小分子化合物，主要包括：1.表观修饰类小分子化合物-VPA(丙戊酸)），丁酸钠，BIX-01294，Scriptaid；2. TGF-Beta信号通路抑制剂；3.在体细胞中过量表达OCT4对克隆的影响,探讨改善体细胞重编程技术路线以及进一步阐明其分子机理。

通过体细胞核移植（SCNT）获得克隆动物为良种公畜的扩繁、农业动物优良经济性状的引入或者改良以及再生医学的细胞治疗提供了很大的希望和无限的可能。但由于体细胞重编程不完全和机制不明导致的克隆效率低下以及克隆动物异常限制了体细胞核移植的应用。有多项研究成果表明通过小分子化合物的应用可以改善提高SCNT重编程效率和质量。本探讨了利用能够有效改善和提高iPS重编程效率的小分子化合物改善克隆效率，建立猪的基因组编辑技术平台。主要研究结果显示：1. 1.50 nM 小分子化合物BIX-01294处理不仅能够极显著的提高猪SCNT胚胎体外发育能力（囊胚率16.4% VS 23.2%，p<0.05），而且对体内胚胎的发育也有所提高（克隆效率1.59% VS 2.96%）；其作用机制可能是通过改善了组蛋白修饰H3K9me2和H3K9me在2- and 4-细胞阶段的异常高表达引起的，也可能是源于提高了多能性相关基因SOX2、NANOG和OCT4的转录水平引起的；而且不是通过提高组蛋白乙酰化水平实现的。2. 25uM小分子化合物REPSOX可以显著提高猪SCNT的克隆效率；其作用机制是通过提高多能相关基因尤其是NANOG的表达来实现的；添加小分子化合物Repsox后其胚胎中细胞凋亡率没有影响。3. KDM5B在猪早期胚胎发育过程中的表达具有阶段特异性;敲低引起了H3K4me3在4-细胞和囊胚阶段胚胎中的异常高表达，显著降低了猪的早期胚胎发育能力（囊胚率23.1% VS 12.4%）和囊胚质量（平均囊胚细胞数52.3±1.69 VS 38.3±1.38），可能作用机制为破坏了H3K4me3-H3K27me3的共价平衡，进而导致HOX基因家族的高表达引起胚胎发育能力下降。4利用TALENs技术对GGTA1基因和帕金森病相关基因（Parkin和DJ-1）进行了基因打靶并获得动物，脱靶检测结果显示三对TALENs均无脱靶效应，成功建立了猪体细胞中高效基因打靶的平台。 上述工作为高效的进行猪的基因组修饰和猪早期胚胎发育提供了解决方案和理论基础。