棉铃虫和烟青虫信息素结合蛋白功能的体内研究

Two sympatric species, Helicoverpa armigera and H. assulta, use the same two aldehydes, cis-11-hexadecenal (Z11-16:Ald) and cis-9-hexadecenal (Z9-16:Ald), as their major pheromone components, but in opposite ratios (97:3 and 7:93). OR13 in H. armigera is highly responsive to Z11-16:Ald and OR14b in H. assulta is strongly stimulated by Z9-16:Ald. There are three pheromone binding proteins (PBPs) in both species respectively. The in vitro fluorescence binding assay showed that PBP1 and PBP2 bind to the aldehydes with similar binding affinity. However, binding assay can not faithfully mimic in vivo physiological conditions. The in vivo experiments are desperately needed to verify the functions of PBPs. We will employ the GAL4-UAS and LexA/LexAop binary expression tools to express corresponding PBPs with OR13 and OR14b in T1 sensillum of Drosophila to study the PBPs functions by the comparison of the response characteristics of OR13 and OR14b. Moreover, we will take advantage of CRISPR-Cas9 method to mutate the important PBPs and verify their roles in the detection of major pheromone components by single sensillum recordings and wind tunnel.

棉铃虫和烟青虫是两个近缘种，性信息素主要组分都是顺11-十六碳烯醛 和顺9-十六碳烯醛，但比例却完全相反（97:3和7:93）。棉铃虫的OR13对Z11-16:Ald有很强的反应，Z9-16:Ald是烟青虫OR14b最好的配体。棉铃虫和烟青虫各有3个信息素结合蛋白（Pheromone binding proteins，PBPs），体外结合实验证明PBP1和PBP2对这两种醛的结合能力没有明显的差异，但是体外实验并不能真实反应体内的情况，还需要体内实验来阐明PBPs的功能。本研究将利用表达工具GAL4-UAS和LexA/LexAop把相应的PBPs与OR13和OR14b共同表达在果蝇的T1感器中，通过对比有无PBPs存在的条件下ORs的反应特点的变化来确定PBPs的功能。另外，本项目将利用CRISPR-Cas9技术突变重要的PBPs，联合单感器记录技术和风洞技术来验证PBPs的功能。

棉铃虫是我国广泛发生的一种鳞翅目害虫，主要性信息素组分为顺11-十六醛 (Z11-16:Ald)。在昆虫外周嗅觉感受系统中主要有两种蛋白：气味结合蛋白 (odorant binding proteins，OBPs) 和嗅觉受体 (odorant receptors，ORs)。棉铃虫有3个信息素结合蛋白 (pheromone binding proteins，PBPs) 和2个普通气味结合蛋白 (general odorant binding proteins, GOBPs)，它们在棉铃虫感受Z11-16:Ald过程中的作用还不清楚。首先，我们利用免疫荧光染色研究了棉铃虫OBPs和GOBPs在棉铃虫雄性触角上的分布。结果表明HarmPBPs表达在感受信息素的毛型感器中，而HarmGOBPs表达在感受普通气味的锥型感器中。接下来，我们研究了HarmPBPs和HarmGOBPs与信息素受体HarmOR13的定位关系。我们发现HarmPBP1和HarmPBP2与HarmOR13表达在棉铃虫触角同一个感器中，而HarmPBP3，HarmGOBP1和HarmGOBP2与HarmOR13表达在不同感器中，说明HarmPBP1和HarmPBP2对棉铃虫感受Z11-16:Ald很重要。然后，我们利用UAS-GAL4和LexA-LexAOP分别表达HarmPBPs和HarmOR13到果蝇T1神经元的支持细胞和嗅觉受体神经元中，并利用单感器记录研究了PBP与OR的功能互作。结果表明HarmPBP1和HarmPBP2可以增强HarmOR13对Z11-16:Ald的反应强度，但对HarmOR13反应选择性和失活没有影响。此外，HarmPBP3对HarmOR13的反应强度和选择性均没有影响。综上，本项目的研究证明HarmPBP1和HarmPBP2参与到棉铃虫对Z11-16:Ald的嗅觉感受中，为研究昆虫OBP与相应受体的功能互作提供了一个新的思路。