整合子自身结构及宿主细菌对其捕获与表达耐药性基因盒调控机制的研究

临床耐药基因的播散、多重耐药菌株的出现给抗感染治疗带来了巨大挑战。近年来的研究表明整合子在细菌耐药基因的水平播散以及多重耐药菌株的出现中起重要作用。整合子可通过位点特异性重组捕获与表达外源基因盒，但其剪切与整合基因盒的机制仍未明了。我们前期研究结果表明，外源基因盒整合频率与attI1位点上游的可变区启动子的种类密切相关，提示可变区基因盒的表达与整合子捕获外源性基因盒之间存在某种调控机制，有研究表明细菌在不利于其生长的环境中，可通过SOS反应系统调控整合子捕获基因盒的效率，说明宿主菌中可能存在调控整合子捕获耐药性基因盒的因素。我们拟从整合子自身结构出发，明确整合子可变区基因盒的表达与整合酶蛋白的表达及其催化的位点特异性重组之间的关系，通过在标准菌株中建立转座子插入突变文库以及免疫共沉淀来寻找宿主菌中调控整合子捕获与表达耐药性基因盒的因素，研究结果为临床控制耐药性基因快速播散提供理论依据。

本项目按计划完成了整合子自身结构及宿主细菌对其捕获与表达耐药性基因盒调控机制的全部研究内容。通过构建含有不同可变区启动子Pc及不同Pc与P2组合的整合子，检测整合子自身结构对其捕获与表达耐药性基因盒的影响，发现第1类整合子中不同可变区启动子下游耐药基因盒的表达水平存在显著差别，可赋予宿主细菌不同的耐药水平。不同可变区启动子，即不同基因盒表达水平可影响整合酶催化的外源基因盒整合频率，外源基因盒整合频率与可变区启动子相对强度，即attI1位点下游基因盒的表达水平成负相关，同时P2启动子的出现可使整合频率明显降低，本研究结果使整合酶催化的基因盒位点特异性重组与基因盒表达这两个相互独立的过程联系起来，为进一步对整合子捕获与表达耐药性基因盒调控机制的研究提供了新的线索与思路。在对临床菌株中整合子及可变区启动子的分布情况进行研究时发现，其可变区启动子以弱启动子为主，其具有较强的捕获外源性耐药基因盒的能力，同时发现一种新的功能性第2类整合子，在临床菌株中以克隆株形式播散，需加强监测以防止细菌耐药性的产生和播散。建立了高分辨率熔解曲线法快速区分第1类整合子可变区启动子及鉴定功能性第2类整合子的方法。本项目通过转座子随机插入突变及免疫共沉淀法对宿主细菌中调控整合子捕获与表达耐药性基因盒的因素进行探索性研究，找到了3个基因（过氧化氢酶/过氧化物酶HPI（I）基因、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PPC）基因、ATP依赖的蛋白酶ATP结合亚单位（clpx）基因）的插入突变可改变整合酶基因的表达水平，为进一步研究整合子捕获与表达耐药性基因盒的调控机制提供新的线索。本项目到目前共发表期刊论文5篇，其中SCI收录2篇，其中1篇发表在影响因子大于5分的杂志上，达到了预期目标。