马铃薯二十八星瓢虫中肠Bt Cry7Ab3毒素受体蛋白的鉴定及功能分析

This is the first report that Bt Cry7Ab3 toxin had insecticidal activity against larvae of Henosepilachna vigintioctomaculata (Coleoptera: Coccinellidae) . Cry7Ab3 toxin had been verified its toxicity against H. vigintictomaculata by Cloning and expression of cry7Ab3 gene.220kDa protein was identified as the Cry7Ab3 toxin receptor in H. vigintioctomaculata BBMV using Cry7Ab3 polyclonal antibody. This project will focuse on identification and function analysis of receptor protein of Cry7Ab3 toxin. All works will be done as following. Monoclonal antibody of Cry7Ab3 toxin is prepared and used to detect receptor protein by ligand blotting and mass spectrometric analysis. The complete gene sequence of receptor protein is obtained based on midgut cDNA library construction and probe hybridization detecting techniques.?The toxin-binding region of receptor protein is gotten by Western blotting and binding kinetics. Toxin-binding region of receptor protein is expressed in Escherichia coli. Synergistic toxic effect about the receptor protein and Cry7Ab3 toxin against H. vigintioctomaculata larvae was detected by the method of leaf-dipping. Results obtained may contribute to a better understanding of the mechanism of Cry7Ab3 toxin against H. vigintioctomaculata insect and offering genetic resource for the study of transgenic plant.

Bt Cry7Ab3毒素是申请者首次研究报道对马铃薯二十八星瓢虫具有特异杀虫活性的蛋白，已经克隆表达该基因并证实Cry7Ab3毒素的杀虫毒力，多克隆抗体检测到Cry7Ab3毒素与该虫中肠220kDa的蛋白特异结合。为明确Cry7Ab3毒素受体蛋白的种类、基因序列及功能特性，本项目拟研究：（1）制备Cry7Ab3毒素的单克隆抗体，通过ligand blotting和质谱分析检测并鉴定受体蛋白的种类。（2）构建马铃薯二十八星瓢虫中肠cDNA文库，利用探针杂交检测技术得到受体蛋白全长基因。（3）利用Western blotting杂交技术并结合动力学测试，得到受体蛋白毒素结合区序列并验证该受体为Cry7Ab3毒素的特异结合受体。（4）通过受体蛋白毒素结合区表达产物和Cry7Ab3毒素协同毒力测定，明确受体蛋白对Cry7Ab3毒素毒力的影响，为更好地应用Cry7Ab3毒素提供理论依据。

（1）通过Ligand blotting技术检测到Bt Cry7Ab3毒素在马铃薯瓢虫中肠存在分子量为220kDa的钙粘蛋白，该蛋白和双翅目致乏库蚊、埃及伊蚊的钙粘蛋白具有同源性，这是首次研究报道马铃薯瓢虫中肠毒素受体蛋白为钙粘蛋白。.（2）通过设计特异性引物分别原核表达不同长度的cry7Ab3基因片段，检测到Cry7Ab3蛋白最短活性区序列为分子量75kDa的Met1-Phe657肽段，72h 时对马铃薯瓢虫幼虫具有最高毒力，这是首次研究报道对鞘翅目昆虫高毒力的Cry毒素最短活性区。.（3）通过Illumina高通量测序技术对马铃薯瓢虫中肠组织进行转录组测序，得到五种假定的Bt毒素结合受体蛋白（钙粘蛋白、氨肽酶蛋白APN、碱性磷酸酶蛋白、ABCC转运家族蛋白和ADAM蛋白），以鞘翅目actin为内参基因利用半定量PCR方法检测假定的Bt毒素受体蛋白在不同虫态表达量差异，结果表明actin基因在马铃薯瓢虫不同虫态表达量相一致时，不同受体基因的表达量存在一定的差异，其中钙粘蛋白Cadherin (HviCad) 和ADAM (HviADAM) 基因在卵期有较弱的表达， ABCC转运家族蛋白(HviABCC)基因的表达量少于其他基因的表达量。.（4）利用毒饵饲喂法得到Cry7Ab3毒素和Cry1Ie2毒素对马铃薯甲虫初孵幼虫都具有较高的毒力，分别利用胰蛋白酶和马铃薯甲虫中肠蛋白酶液体外酶解，结果得到130kDa的Cry7Ab3原毒素酶解均得到65kDa的酶解产物，而81kDa的Cry1Ie2原毒素被胰蛋白酶酶解为55kDa的毒素，被马铃薯甲虫中肠蛋白酶液酶解为65kDa的毒素，通过Ligand blotting 技术检测到马铃薯甲虫中肠BBMV上存在分子量为45kDa的ABCC2蛋白，利用RACE技术得到ABCC2蛋白的部分序列，这是国内外首次研究报道马铃薯甲虫中肠毒素受体蛋白为ABCC2蛋白。.（5）利用RNAi干扰的方法鉴定结合受体蛋白APN的功能。分析APN蛋白序列合成siRNA注射幼虫体内，注射siRNA后抑制了APN蛋白的表达而不能发挥结合受体蛋白的功能，不能和Cry毒素蛋白结合，取食Cry毒素蛋白幼虫生长发育不受到影响，同时Cry毒素蛋白对注射PBS缓冲液和未注射幼虫都表现出毒杀作用，证实了氨肽酶APN蛋白具有中肠结合受体蛋白的功能。