二化螟中肠Cry1A毒素功能受体的鉴定

我国自主研发的转Bt抗虫水稻已于2010年取得转基因生物安全证书，即将进入商业化种植阶段。转Bt抗虫水稻表达的外源杀虫蛋白主要是Cry1A毒素，二化螟是其重要的靶标害虫。配基结合试验表明，二化螟中肠BBMV中存在多个Cry1A毒素结合蛋白，但导致Cry1A产生毒杀作用的功能受体仍不明确。本项目采用Pull-down技术和交联/标记转移技术，扩大结合蛋白的诱集范围，筛选捕获二体螟中肠BBMV上Cry1A毒素的功能受体。然后，利用昆虫细胞系进行异源表达，从亲合力、结合性及细胞毒性等方面对其进行验证，并通过RNA干扰技术研究受体蛋白的生理功能。本研究结果既可揭示Bt毒素对二化螟的作用方式，同时又为二化螟Bt抗性分子机理的研究奠定基础，为二化螟Bt抗性的田间监测及抗性治理提供理论依据。

在二化螟中肠上存在多种Cry1Ac毒素的结合蛋白，但导致Cry1Ac产生毒杀作用的功能受体仍不明确。确定二化螟体内Cry1Ac毒素的功能受体对于阐明Bt毒素的作用机制具有重要意义。本项目利用Pull-down技术在非变性条件下捕获了二化螟中肠Cry1Ac毒素的结合蛋白。利用LC-MS/MS方法对结合蛋白样品进行了分离鉴定。结果表明这些蛋白可分为三类：第一类是已确认的其它昆虫体内Cry1Ac毒素的功能受体，包括钙粘蛋白及氨肽酶系（APN1、APN3和APN4）。第二类是已报道的昆虫体内Cry1Ac毒素的结合蛋白，包括V-ATP酶亚基和热激蛋白。第三类是大量与代谢、细胞信号调控相关的蛋白，这些蛋白与Cry1Ac的结合性以及是否参与毒杀作用尚未见报道。本项目利用RNA干扰技术（菌液喂饲法）对结合蛋白中的氨肽酶系、钙粘蛋白是否为Cry1Ac毒素的受体进行了功能验证。在连续取食含有dscad、 dsapn1、dsapn3或dsapn4的菌液后，二化螟幼虫体内相应基因的表达量分别降低了40%、30%、41%及36%。但在Cry1Ac活化毒素处理浓度为0.8 µg/100 µl时，只有取食了dscad、dsapn4的幼虫的死亡率降低到66.5%和65.6%，明显低于对照幼虫和喂食dsgfp的幼虫，且差异达到极显著水平。结果表明经RNA干扰后，钙粘蛋白和APN4在二化螟体内的表达量降低，从而有效减少了与Cry1Ac活化毒素的结合量并造成二化螟幼虫对毒素的敏感性下降。由此说明钙粘蛋白和APN4可能做为功能受体参与了Cry1Ac毒素对二化螟的毒杀作用。