杨盘二孢菌效应因子功能分析与无毒基因克隆

杨树是我国重要的工业用材和绿化树种，在产生巨大经济效益的同时，还对维持生态环境起着无可估量的作用，但杨树人工林林分结构单一，分布集中，极可能发生森林病害爆发和流行，因此迫切需要研究杨树-病原微生物相互作用机制，为遗传改良杨树抗病性状提供理论基础。.随着植物病理学的发展，现今普遍认为植物存在天然免疫系统，病原微生物通过效应因子克服植物天然免疫系统，实现有效定殖。杨树做为木本植物中的模式树种，与病原微生物相互作用机制研究严重滞后；迄今还未见杨树病原微生物无毒基因克隆报道，而且更没有相应R基因克隆的报道。.申请人在之前的国家自然科学基金青年基金资助下，搭建了候选效应因子发现与功能分析研究平台。在此基础上，我们准备高通量筛选杨树病原真菌-杨盘二孢菌的候选效应因子，解析效应因子蛋白在致病过程中的功能，同时克隆杨盘二孢菌无毒蛋白基因，为克隆相应的杨树抗性基因和阐述杨树效应因子触发的免疫创造条件。

杨树是多年生木本植物中的模式树种，但杨树与其病原微生物相互作用机制的研究滞后。根据植物分子免疫学理论，病原微生物的效应因子是病原微生物操纵植物细胞和建立定殖的关键，而且也是植物识别病原微生物的靶标。因此我们针对杨树黑斑病病原真菌-杨盘二孢菌的效应因子基因展开了研究。. 真菌效应因子通常为小分子量分泌蛋白，在杨盘二孢菌中有423个基因编码此类蛋白。进入一步研究发现其中107个基因具有一定的序列相似性，我们将其命名为IGYP基因。通过细致的生物信息学分析，发现这107个IGYP基因具有一致的基因结构并且编码保守的序列模块。通过在公共数据库中查找分析，发现26个双核亚界真菌中都携带IGYP基因，并且在11个真菌中的18个IGYP基因具有相似的基因组结构。因此在本次研究中，我们首次鉴定一个广泛分布于子囊菌和担子菌中的效应因子基因家族-IGYP基因家族。. 结合RT-PCR和高通量测序（RT-PCR-seq)，我们重新注释了杨盘二孢菌107个IGYP基因，并且发现在9个IGYP基因中具有10个可变剪接位点。为了分析IGYP基因的功能，我们建立并优化了农杆菌介导的杨树叶片瞬时表达技术，并且构建了103个IGYP基因的植物表达载体。瞬时表达结果发现MbIGYP13可在抗黑斑病杨树叶片中诱导细胞死亡。因此MbIGY13可作为杨盘二孢菌中的候选无毒蛋白。. 杨盘二孢菌 IGYP蛋白与卵菌RxLR 效应因子具有广泛的相似性，而且部分 IGYP蛋白具有明显的细胞核定位信号，再进入实验也证实了细胞核定位。因此我们建立了杨树非原质体和细胞内蛋白分离方法，目前正在研究IGYP蛋白的跨膜转运机制。