杨生褐盘二孢菌效应因子MbSR1抑制RNA沉默的功能及机制研究

In plants, RNA silencing serves as a core mechanism for the immune system, as well as the key target of effectors produced by pathogenic microorganisms. Recent evidences have suggested that viruses, bacteria and oomycetes generally manipulate plant RNA silencing by effectors to facilitate colonization. However, such function in fungi pathogen effectors, to date, is still unkown. In previous studies, we have searched for poplar plant pathogen Marrssonina brunnea effectors that suppress RNA silencing in poplar by high throughput screening in Nicotiana benthamian 16c system, and MbSR1 effector was identified, but its function and the underlying mechanism in the process of infection remains uncharacterized. Here, this project will employ Marrssonina brunnea gene knock-out and poplar transgenic technology to elucidate toxicity mechanism of MbSR1. Subcellular localization analysis will be carried out to precisely locate the function position of MbSR1. We will further investigate the specific step(s) during RNA silencing which is disrupted by MbSR1 through Northern blotting and a new generation of small RNAs sequencing technology. To further identify the key activity position of MbSR1 for suppressing RNA silencing, bioinformatics analysis combined with Agrobacterium tumefaciens co-infiltration assay will be used. Our project will only provide mechanistic insights into fungi effectors and plant RNA silencing, but also affords molecular targets and theoretical basis in polar black spot disease control.

RNA沉默是植物免疫系统的核心机制，同时也是病原物效应因子作用的关键靶标。目前已证明病毒、细菌和卵菌普遍通过效应因子操纵寄主RNA沉默实现定殖，但人们还未取得真菌效应因子作用于RNA沉默的直接例证。前期研究中，通过在16c本氏烟中高通量筛选杨树病原真菌-杨生褐盘二孢菌效应因子，申请人鉴定出具有抑制RNA沉默功能的MbSR1，但其在侵染杨树过程中的功能及作用机制还未阐明。本项目拟用杨生褐盘二孢菌基因敲除和杨树转基因技术，阐明MbSR1毒性机制；通过亚细胞定位观察，精确定位MbSR1发挥功能的位置；利用Northern印迹杂交和新一代小RNA测序技术，揭示MbSR1抑制RNA沉默的作用途径；应用生物信息学方法结合农杆菌共浸润瞬时抑制分析实验，鉴定MbSR1抑制RNA沉默的关键活性区域。研究成果不仅可促进对真菌效应因子和植物RNA沉默机制的认识，也为杨树黑斑病的抗病分子设计提供靶标与理论依据。

RNA沉默是植物免疫系统的核心机制，同时也是病原物效应因子作用的关键靶标。目前已证明病毒、细菌和卵菌普遍通过效应因子操纵寄主RNA沉默实现定殖，但人们还未取得真菌效应因子作用于RNA沉默的直接例证。基于前期发现真菌--杨生褐盘二孢菌分泌的IGY效应因子家族与卵菌RxLR效应因子家族在基因扩张、成员间序列分歧和基因表达等方面具有高度相似性，本研究通过农杆菌共浸润抑制分析法高通量筛选IGY效应因子，鉴定出具有抑制RNA沉默功能的杨生褐盘二孢菌RNA沉默抑制子MbSR1（Marrssonina brunnea Suppressor of RNA Silencing 1）。本研究首先基于成功建立的杨生褐盘二孢菌的孢子电转化体系，将MbSR1在杨生褐盘二孢菌敲除后，不影响杨生褐盘二孢菌的营养生长、产孢及孢子萌发等性状，但致使致病力显著下降，表明MbSR1是杨生褐盘二孢菌的致病相关基因；MbSR1蛋白定位于烟草细胞的细胞核和细胞质中，而只定位于寄主杨树中的细胞核中，表明MbSR1分泌到植物体内后主要在细胞核内发挥作用；过表达MbSR1后，还可增强对多种病原菌（如烟草疫霉和杨树壳针孢病原菌）的敏感性，同时，MbSR1还可局部抑制由多个R基因触发的细胞死亡，表明MbSR1既可以抑制基础免疫反应，又可以抑制由效应因子触发的免疫反应；MbSR1在杨树中的表达影响了小RNA的生物合成，包括许多siRNAs和一些与调控防卫反应密切相关的miRNAs，初步解析了MbSR1致病的作用机制。MbSR1为国内外首例在真菌病原菌中发现的RNA沉默抑制子，本研究初步揭示了MbSR1效应因子作为RNA沉默抑制子的功能与具体作用机制，表明MbSR1是一个多功能的效应蛋白，可通过改变作为防卫调控因子的小RNA的合成，进一步影响R基因触发的一系列防卫反应。同时也进一步证明了在病原微生物与寄主共进化过程中，干扰或抑制寄主沉默免疫机制是病原微生物所普遍采用的致病策略。研究成果不仅可促进对真菌效应因子和植物RNA沉默机制的认识，对深入理解杨树与杨生褐盘二孢菌的互作机制具有重要的借鉴和指导意义，也为针对杨树黑斑病指导开发高效杀菌剂提供重要的理论依据。