硫酸软骨素代谢异常在大骨节病软骨损伤中的作用研究

The relationship between the cartilage damage of Kashin-Beck disease (KBD) and environmental risk factors is still unknown. The hypothesis that environmental risk factors disturb chondroitin sulfate metabolism, affect the integrity of the cartilage extracellular matrix structure and function, resulting in cartilage damage of KBD is uncertain. Based on this, human samples were collected and cell experiments were carried out, by in vitro cell culture, western blot, quantitative real-time PCR and other molecular biology techniques, results from human tissues, cells, genes and proteins levels were acquired and analyzed. First of all, the relationship of chondroitin sulfate-specific expression metabolic enzymes and KBD cartilage damage from human samples were determined; furthermore, environmental factors T-2 toxin and low selenium were used to intervene with the normal cartilage cells, to explore how they affected the chondrocytes by chondroitin sulfate metabolism; meanwhile, by supplementing KBD chondrocyte with nano-selenium chondroitin sulfate, the apoptosis inhibition effect was investigated with chondroitin sulfate metabolism. The accomplishment of the project can promote the prevention and treatment of KBD.

针对大骨节病软骨损伤和环境致病因素不明的关键问题，提出环境可疑致病因素通过引发硫酸软骨素代谢的不平衡，影响软骨细胞外基质结构和功能的完整性，导致大骨节病软骨损伤的假说。在此基础上，采用人体样本与细胞实验相结合的方法，应用体外细胞培养、蛋白免疫印迹、实时定量PCR等分子生物学技术，从人体组织、细胞、基因、蛋白不同层面展开研究。首先从人体组织样本结果，确定硫酸软骨素代谢酶的特异性表达与大骨节病软骨损伤的关系；籍此为基准，通过环境可疑致病因子T-2毒素、低硒的实验设计干预正常软骨细胞，探索其引起大骨节病软骨损伤与硫酸软骨素代谢的关系；同时，通过补充纳米硒研究其对KBD软骨细胞凋亡的抑制作用和硫酸软骨素代谢的关系。为有效推进大骨节病的预防和治疗水平，提供新的科学依据。

本项目针对近年来大骨节病软骨损伤机制和环境致病因素关系不明的关键问题，提出环境可疑致病因素通过引发硫酸软骨素代谢的不平衡，影响软骨细胞外基质结构和功能的完整性，导致大骨节病软骨损伤的假说，项目的完成将会提高大骨节病的预防和治疗水平。人群实验研究表明在KBD和OA软骨中硫酸软骨素硫酸化酶CHST-3，CHST-11，CHST-12，CHST-13，CHST-15和UST的表达水平降低。与OA软骨相比，在KBD软骨中观察到较少的硫酸软骨素硫酸化酶；由此说明硫酸软骨素硫酸化不足，特别是硫酸软骨素硫酸化酶的缺陷表达可能对软骨基质的完整产生影响，进而引起OA，特别是在KBD关节软骨中的损伤。动物实验结果显示在低硒组大鼠膝软骨CHST-3、CHST-12和UST的阳性染色率均不同程度低于对照组。因此，低硒可以引起硫酸化酶表达缺陷和硫酸软骨素不足，对软骨细胞和胞外基质产生损伤作用。C28/I2软骨细胞实验发现低硒和T-2 毒素对正常软骨细胞有严重的损伤作用，细胞活力降低，线粒体，内质网等细胞器也有相应的受损改变，虽然细胞内硫酸化相关基因CHST13、CHST15和UST表达上调，但是蛋白的表达下调，结合细胞数量显著减少的趋势分析，T-2、低硒以及二者联合作用后硫酸化相关酶的表达减少会影响细胞正常代谢过程，硫酸软骨素合成与修饰，从而损伤细胞外基质。KBD软骨细胞实验结果显示补硒对KBD患者软骨细胞有一定的保护作用，在纳米硒的作用下，细胞活力升高，线粒体等细胞器状态也有好转迹象。在T-2 毒素组，KBD细胞数量急剧减少，而补硒联合T-2 毒素组细胞数量有所升高。研究说明在纳米硒的干预下，KBD 患者软骨细胞中硫酸软骨素相关硫酸化酶在基因和蛋白水平的表达差异，影响KBD 软骨细胞的损伤修复以及T-2毒素诱导的软骨细胞的损伤修复。本项目已经发表相关SCI论文7篇，其中6篇为第一标注，Medline论文1篇（第一标注），申请发明专利1项。