miR-140在大骨节病儿童关节软骨损伤中的作用

For the key issues on the unknown pathogenesis on cartilge lesions and less early preventive methods of pathogenic factors of Kashin-Beck disease children,using molecular biology and animal experiment technologies,the project will study the role of miR-140 and its upstream or downstream genes in low selenium∕T-2 toxin-induced cartilage injuries,and serch new method for preventing Kashin-Beck disease children. The main contents cover:(1)determining the expression of IL-1βor miR-140 or ADAMTS5 in the blood or cartilage of Kashin-Beck disease children by RT-PCR or ELISA or in situ hybridization; (2) clarifing the role of miR-140 and ADAMTS5 in low selenium∕T-2 toxin-induced cartilage injuries by constructing miR-140 overexpression and miR-140 knockdown mice;(3)evaluating the effects of trying to stop the cartilage injuries induced by low selenium∕T-2 toxin by in vivo injecting the specific antibody to nertralizing the early responsing IL-1βinduced by low selenium∕T-2 toxin. The project aims to illustrate the causal links among the low selenium∕T-2 toxin and abnormal change genes or miRNA (such as IL-1β，miR-140，ADAMTS5) and cartilage injuries,to offer the important evidences for the pathogenesis on cartilge lesions of Kashin-Beck disease children,to supply the scientific evidences for developing novel methods for preventing and curing Kashin-Beck disease children.

针对大骨节病儿童软骨损伤的发病机制未明，缺乏有效的早期防治方法的问题，采用分子生物学和动物实验技术，研究miR-140及其上、下游调控基因在低硒加T-2毒素软骨损伤中的作用，探索防治大骨节病儿童的新方法。内容包括：（1）采用RT-PCR、ELISA和原位杂交方法确定IL-1β∕miR-140∕ADAMTS5在大骨节病儿童血液和软骨组织的表达；（2）构建miR-140过表达及敲减转基因小鼠，明确miR-140∕ADAMTS5在低硒加T-2毒素引起软骨损伤中的作用；（3）给予特异性抗体中和低硒加T-2毒素诱导的较早反应基因IL-1β，评价该方法阻止低硒加T-2毒素引起软骨损伤的效果。本项目阐明低硒加T-2毒素、变化的基因或miRNA（IL-1β∕miR-140∕ADAMTS5）、软骨损伤之间因果联系，为探讨大骨节病儿童软骨损伤的发病机制提供重要依据，亦为研发大骨节病儿童防治新方法提供科学依据。

本研究发现大骨节病儿童的软骨损伤可能是环境致病因素与体内反应变化的基因相互作用的病理过程，本实验检测出IL-1β在儿童大骨节病患者体内升高，同文献报道的实验结果一致。在环境致病因子的作用下，IL-1β升高，研究显示IL-1β可以诱导破骨细胞、成纤维细胞和软骨细胞等释放胶原酶降解胶原蛋白和细胞外基质。IL-1β与软骨细胞表面的IL-1R结合，激活软骨细胞内信号通路，通过NF-kB途径，诱导软骨细胞的MMP13(可以降解COL2)、ADAMTS5（可以降解蛋白聚糖）、MMP1表达增加,导致软骨基质的降解、软骨细胞变性和坏死。儿童大骨节病人血液中IL-1β升高，miR-140表达降低，为了探讨IL-1β和miR-140之间的关系，首先，给予野生型小鼠低硒加T2毒素处理（模拟大骨节病的环境致病因素）。与对照组比较，低硒加T2毒素可以引起小鼠关节软骨IL-1β升高，miR-140表达降低。借鉴骨关节病的发病机制的研究资料，IL-1β可降低mir140在软骨细胞中的表达，并调控miR-140的下游基因（例如ADAMTS5）参与骨关节病的发病。然后，建立敲减和过表miR-140的小鼠，给予敲减和过表miR-140小鼠低硒加T2毒素处理，本实验结果显示低硒加T2毒素处理可以升高IL-1β，IL-1β可以诱导miR-140的降低，miR-140通过调控其靶基因ADAMTS5、MMP13，促进软骨组织中的蛋白聚糖和COL2的降解，使关节软骨损伤。因此，本研究提出大骨节病儿童软骨损伤的发病机制可能是：环境致病因子（低硒+T2毒素）作用下，大骨节病儿童体内IL-1β增高，在IL-1β作用下，大骨节病儿童的关节软骨组织miR-140降低，miR-140通过调控其靶基因ADAMTS5、MMP13，使ADAMTS5和MMP13表达增加，促进软骨组织中的蛋白聚糖和COL2降解，使关节软骨损伤。