细胞周期检验点维持DNA复制叉和基因组稳定性的机理

To stabilize DNA replication forks is directly related to genomic stability. The checkpoint ATR-Chk2 pathway has been proved essential to stabilize stalled replication forks and overcome replication barriers. In the absence of ATR or Chk2, stalled replication forks reverse to form pathological chicken-foot structure that results in incomplete DNA replication, dsDNA breaks, unscheduled DNA recombination, all of which cause genomic instability. How ATR- or Chk2-mediated checkpoint stabilizes DNA replication forks is still an open question. We discover that ATR-Chk2 phosphorylates Dna2 and stabilizes Dna2 associating with stalled replication forks for preventing stalled fork from reversing. The further studies will examine what are roles of the Dna2 interacting protein Rqh1 and Cdc24 in preventing fork reversal and facilitating crossing of replication over replication barriers. We recently found, through large-scale screening,that the protein kinase ppk19 is a protein targeted by Chk2 and plays an critical role in stabilizing stalled replication forks and maintaining genomic integrity. In this program, we will study the mechanism how ppk19 maintains genomic stability.

维持真核细胞DNA复制叉的稳定直接关联到基因组的稳定。Checkpoint ATR-Chk2介导的通路已被证明是维持停顿的DNA复制叉稳定及推动正常复制叉跨过染色体内在的复制障碍物所必需的。在ATR或Chk2缺失时，停顿的复制叉倒转形成病理的鸡脚爪结构，进而引起复制不能完成、或DNA断裂、重组，最终导致基因组不稳定。ATR及Chk2介导的通路维持复制叉稳定的机理仍是一个待解决的重大问题。我们已发现ATR-Chk2通路通过磷酸化募集Dna2蛋白至染色体上以防止复制叉倒转。进一步的研究将阐明Dna2及其相互作用蛋白Rqh1和Cdc24在防止复制叉倒转及推进复制叉跨过染色体内在的复制障碍物的分子机理。我们最近通过大规模筛选发现蛋白激酶ppk19 在维持DNA复制叉及基因组稳定中起极重要作用。ppk19是Chk2调控的又一个蛋白,我们将对其生物功能及作用机理将作深入细致研究。

真核细胞DNA 复制叉会经常碰到复制障碍物而停顿。停顿的复制叉需要S期的细胞周期检验点（checkpoint）调控以维持复制叉稳定。否则，复制叉会垮塌、并导致DNA复制不能完成、DNA断裂、随机同源DNA重组、染色体异位、及许多其它类型基因组变异。 我们先前发现checkpoint调控核酸酶Dna2防止复制叉倒转，以维持复制叉稳定。但是，checkpoint应该还调控其它更重要的蛋白以维持停顿复制叉稳定。用该重点项目经费、及一些其它经费，我们应该解决了细胞如何维持停顿复制叉的基本分子机理。我们实验室在该研究领域的主要发现如下，文章在评审和投递。.1. 证明裂殖酵母Rqh1作用于防止复制叉倒转；.2. 证明人细胞Dna2，和裂殖酵母Dna2一样，也防止停顿复制叉倒转、以维持复制叉稳定；.3. 我们发现checkpoint直接调控复制解旋酶CMG (Cdc45-MCM-GINS)复合体以维持停顿复制叉稳定。其具体机制如下：当复制叉停顿后，Chk2磷酸化Cdc45亚基，导致CMG解旋酶活性降低。这样，CMG解旋酶和DNA复制合成酶在功能上维持偶联，使得停顿复制叉稳定。我们认为这个机制是checkpoint维持停顿复制叉稳定的根本机制。.4.我们还发现了一条新的维持停顿DNA复制叉稳定的通路，我们叫它Chromsfork通路：chromatin compaction stabilizes stalling replication forks。我们发现当复制叉停顿后，复制叉附近的核小体变得更紧密、和DNA相互作用更强。 核小体的这些变化是通过核小体组蛋白的化学修饰导致的，包括H2BK33去乙酰化（新发现的乙酰化位点），H3K9三甲基化等。如果打破该调控，则造成停顿复制叉不稳定。.细胞如何维持停顿DNA复制叉稳定，是一个极其重要的问题，已经研究20多年了。 通过第3、4条的发现，我们实验室应该解决了这个长期悬而未决的问题。