GMCSF调控MMP-2和MMP-9在创面修复血管新生中的分子生物学机制

The process of wound healing is an intricate and coherent biological activity involving inflammation, angiogenesis, and remodelling. However, the molecular and biological mechanism of angiogenesis is to be elucidated. Our previous study showed that GMCSF activated NF-κB and enhanced the expression of VEGF in fibroblasts, which promoted the proliferation and migration of endothelial cells and the formation of new blood vessels. In addition, we found that GMCSF induced the expression of MMP-2 and MMP-9, and activated the AP-1. Based on above and literatures, our hypothesis is that GMCSF induces the expression of MMP-2 and MMP-9 via activating JNK-AP-1 pathway. It has been reported that MMPs can cause degradation of the base-membrane of blood vessels, which is crucial for angiogenesis. Therefore, we speculate that GMCSF-JNK/AP-1-MMPs plays a critical role in regulation of angiogenesis during wound healing. This study attempts to prove our hypothesis by employing gel zymography, tube formation, and chicken chorioallantoic membrane (CAM) assays.

创面修复过程中血管新生的分子生物学机制尚有待阐明。本课题组前期研究发现GMCSF可激活NF-κB诱导VEGF在成纤维细胞中的合成，然后由VEGF促进血管内皮细胞的增殖和迁移调节血管新生，从而促进创面修复；同时还发现GMCSF可促进MMP-2和MMP-9的表达及AP-1的活化。基于上述发现并结合MMPs在血管新生中的作用，我们假设：GMCSF通过JNK－AP-1信号通路促进MMP-2和MMP-9的表达，降解原有血管基底膜，协同VEGF实施了血管的新生。本课题应用明胶酶谱法、管腔形成率和鸡胚绒毛尿囊膜血管发生等技术，通过体内及体外、从细胞到分子等层面，验证GMCSF通过JNK磷酸化通路活化AP-1促进MMP-2和MMP-9高表达；明确GMCSF－JNK/AP-1－MMPs信号通路协同VEGF调控血管新生中的机制。以期较全面地阐明创面愈合中GMCSF调控血管新生的细胞和分子生物学机制。

创面修复是一个复杂而又高度协调的过程，涉及诸多组织细胞和生物活性介质。（一）探讨单核巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对人皮肤成纤维细胞MMP-2、MMP-9表达的影响以及其分子生物学机制。检测结果显示GM-CSF刺激下人皮肤成纤维细胞MMP-2/-9的表达均明显高于对照组（P<0.05），MMP-2/-9的表达量及活性与GM-CSF浓度呈正相关；成纤维细胞内JNK/c-Jun的磷酸化水平明显高于对照组（P<0.05）；MMP-2/-9的mRNA转录水平显著高于对照组（P<0.05）,提示GM-CSF通过活化JNK/c-Jun信号通路上调成纤维细胞MMP-2和MMP-9的合成、表达与分泌，并促进成纤维细胞的迁移。这一结论是对GM-CSF调控创面愈合分子生物学机制的补充。（二）结构与功能兼备的成熟血管对创面愈合起到了至关重要的作用。我们既往的研究显示GM-CSF能够促进创面愈合，但是在此过程中可能存在的生物学机制，以及GM-CSF与促进血管成熟及维护血管屏障稳定和完整性的关系并不明确。由此我们提出假设:创伤修复中可能存在“GM-CSF－血管周细胞上调Ang-1的表达－促进血管成熟，稳定微血管屏障”这样的机制。为了验证这一假设，我们将采用小鼠创面模型和内皮细胞／血管周细胞共培养体外模型，观察小鼠创面的微血管渗漏情况及体外共培养条件下内皮细胞的通透率。结果显示：外源性GM-CSF通过促进血管成熟，增强血管屏障功能，从而加速创面愈合（1.1倍，p<0.001）。体外实验中，GM-CSF上调了血管周细胞的Angiopoietin-1（Ang-1）的分泌量，增加近10倍（p<0.001），从而在血管内皮细胞／血管周细胞共培养体系中，通过依赖Ang-1的作用，调节内皮细胞间连接，促进血管屏障的完整性（p<0.001）。此外，我们引入RNAi分别在体内外实验中验证siRNAAng-1 能够削弱GM-CSF促进血管成熟，维护血管稳定的作用。因此我们认为，在创面愈合过程中，GM-CSF能够通过促进血管周细胞分泌Ang－1，促进血管成熟和稳定。