在单病毒粒子水平研究石斑鱼虹彩病毒SGIV侵染宿主细胞的机制

Iridoviruses are one of the most important viral pathogens in culture groupers and other marine fishes. However, little is currently known about the infectious entry process of iridovirus into host cells. Based on the previous studies, we will thoroughly investigate the detailed infection mechanism and intracellular motility of Singapore grouper iridovirus (SGIV) in host cells at single-virus particle resolution using biochemistry, molecular biology and biophysical technology. Firstly, we will disclose the pathway of virus entry and the detailed dynamic process. Then, we will investigate the interaction between the virus and the cytoskeleton components during SGIV replication, and analyze the dynamic process during virus movement. In this study, the single-virus tracking will be firstly applied to fish large DNA virus. Our results will not only provide new insights into elucidating the molecular mechanism of fish iridovirus disease, but also contribute greatly to developing novel and effective strategy to preventing fish viral disease.

虹彩病毒是石斑鱼等主要海水养殖鱼类的重要传染性病原，危害极大，然而，目前对这类病毒在鱼类宿主细胞内的精细侵染机制仍不清楚。本项目拟在前期工作的基础上，通过交叉运用生化、分子生物学和生物物理学等技术，在单病毒粒子水平系统开展石斑鱼虹彩病毒SGIV侵染宿主细胞的精细机制研究。在活细胞内直观揭示SGIV病毒进入宿主细胞的方式、途径和精细动态过程，阐明其入膜和跨膜入侵机制；从时间、空间尺度实时动态监测SGIV病毒在复制和运输过程中与细胞骨架成分的相互作用，分析其运输途径、运输过程和动力学特征。本研究首次将单病毒粒子示踪技术应用于鱼类大分子DNA病毒研究，研究结果将从新的角度进一步阐明鱼类虹彩病毒感染致病的细胞基础和分子机制，同时为有针对性地发展鱼类病毒病防控技术奠定基础。

虹彩病毒是一类大分子DNA病毒，不仅给水产养殖产业带来巨大经济损失，而且对生物多样性造成严重威胁。石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus, SGIV）为虹彩病毒科蛙病毒属的一个新种，是海水养殖鱼类的主要病毒性病原之一。然而，目前对SGIV侵染宿主细胞的机制了解尚少。本项目在前期工作基础上，从宿主和病毒两个层次，在时间、空间尺度多层次系统研究了SGIV进入宿主细胞的精细动态过程与机制。取得的一系列创新研究成果简述如下：1）SGIV进入细胞的方式与其它虹彩病毒明显不同，SGIV进入细胞通过pH、dynamin依赖的网格蛋白介导的内吞，而不通过小窝蛋白介导的内吞；并且首次发现虹彩病毒进入宿主细胞的途径亦包括巨胞饮。2）单个SGIV病毒粒子可借助细胞表面的伪足样突起进入细胞；进入细胞内的SGIV运动依赖微丝、微管。3）首次建立了一种基于原子力显微镜的微观生物力测量新方法—力示踪技术，并应用于探讨病毒侵染细胞的跨膜机制，测得SGIV跨膜进入细胞发生的位移、时间、速率以及内吞作用力等动力学数据。4）建立病毒DNA荧光标记体系，初步揭示SGIV病毒DNA释放机制。病毒DNA始终未进入细胞核，与目前报道的虹彩病毒复制机制显著不同。并且病毒DNA释放与内体、微管关系密切。5）建立基于指数富集的配基系统进化技术筛选核酸适配体，获得特异性识别SGIV病毒粒子的核酸适配体，可显著抑制SGIV感染；同时筛选获得特异性识别SGIV感染细胞的核酸适配体，可与靶标结合特异性内吞进入细胞。6）搭建超分辨成像系统dSTORM，阐明膜受体蛋白表皮生长因子受体（EGFR）在细胞膜的成簇分布及调控机制；并且揭示细胞表面多种糖分子的形态分布及成簇机理。7）利用原子力显微镜成像和单分子力谱技术，从进化角度，比较分析了鱼类红细胞膜结构与哺乳动物、鸟类和爬行类红细胞膜结构的差异，揭示了细胞膜结构的相似性和膜蛋白分布的不对称性规律。本研究对深入揭示SGIV感染致病机理，阐明病毒进入宿主细胞的精细动态过程，以及发展海水鱼类病毒病防控关键技术，具有重要的理论意义和应用价值。