斜带石斑鱼JNK信号分子的克隆、表达及其在虹彩病毒SGIV侵染中的作用机制

石斑鱼是重要海水经济养殖鱼类，在高密度集约化养殖条件下各种病害频繁爆发成为其可持续健康发展的主要瓶颈，虹彩病毒SGIV就是其最严重的传染性病原之一。目前，有关石斑鱼对SGIV感染的免疫应答机理仍不清楚。我们的前期研究表明，石斑鱼细胞在SGIV感染引起凋亡过程中，MAPK通路的ERK、JNK及P38途径被激活，其中，JNK途径抑制剂能够明显地推迟SGIV引起的细胞CPE进程，磷酸化JNK信号分子参与SGIV的感染。本项目拟在实验室前期工作的基础上，进一步克隆和表达石斑鱼JNK1/2/3信号分子，系统研究JNK1/2/3在病毒侵染的免疫应答及信息传递过程中的作用机制，分析SGIV侵染对石斑鱼宿主细胞JNK1/2/3信号分子的调节作用。项目研究将为阐明石斑鱼对病毒侵染的先天性免疫应答机理奠定基础，对发展海水鱼类病毒防控关键技术也具有重要的指导作用。

石斑鱼是重要的海水养殖鱼类之一，经济价值极高，石斑鱼养殖疾病的暴发流行造成巨大经济损失。新加坡石斑鱼虹彩病毒 (Singapore grouper iridovirus, SGIV) 是近年来新出现的一种重要的鱼类传染性病毒，可导致石斑鱼死亡率达90%以上。目前，有关石斑鱼对SGIV 感染的免疫应答机理仍不清楚，石斑鱼与SGIV相互作用的分子机制缺乏深入了解。为了更好地了解SGIV感染过程中石斑鱼的免疫应答机理及SGIV与石斑鱼相互作用的分子机制，本项目对天然免疫基因c-Jun氨基末端激酶(JNK信号分子)和β-defensin进行了分子克隆和生物学活性研究。.通过同源克隆及RACE技术，从斜带石斑鱼肝脏组织中成功克隆了多个c-Jun氨基末端激酶（JNK1，JNK2和JNK3）和抗菌肽β-defensin基因，并对JNK1信号分子及抗菌肽β-defensin功能进行了深入研究。.Ec-JNK1编码的氨基酸序列与已报道的鱼类JNK1具有较高同源性，并且含有一个存在磷酸化motif”TPY”的保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(S_TKc)。Ec-JNK1在石斑鱼肝脏、皮肤和肌肉等免疫组织中具有较高的表达量。LPS、SGIV和polyI:C刺激石斑鱼后，Ec-JNK1的mRNA表达量极显著(P < 0.01)升高。病毒感染细胞后，Ec-JNK1亚细胞定位未发生变化。在细胞FHM中过表达和抑制Ec-JNK1磷酸化后，我们发现过表达Ec-JNK1能促进SGIV的感染和复制以及SGIV感染诱导的细胞凋亡，而抑制Ec-JNK1磷酸化后作用相反。因此，在感染石斑鱼细胞的过程中，SGIV能够调节Ec-JNK1的活化状态，Ec-JNK1的磷酸化有利于SGIV在宿主细胞内的高效复制。.防御素是一类在宿主先天性免疫中具有重要作用的内源性抗菌肽。LPS、SGIV和polyI:C刺激石斑鱼后，EcDefensin基因的表达极显著(P < 0.01)增加。免疫荧光结果显示EcDefensin对鱼类病毒SGIV和VNNV具先天性免疫活性。EcDefensin对病毒SGIV和VNNV表现双重抗病毒活性：抑制病毒SGIV和VNNV的感染和复制，诱导I型干扰素相关的免疫反应。合成多肽Ec-defensin和过表达EcDefensin均能显著降低病毒的感染力，调节宿主免疫相关基因Mx和促炎性细胞因子