5′和3′非编码区对PRRSV转录和调控作用机制的研究

The parental virus, PRRSV DY strain, a high virulence strain, was originally isolated by our laboratory, and its complete genome (GeneBank accession JN864948) was cloned by RT-PCR. Then, the replicon vector were constructed by amplification of sequences of hammerhead ribozyme and hepatitis D virus and DY strains of the 5 'UTR (Untranslated region)and 3'UTR, non-structural protein genes, N the structure protein gene and EGFP report gene. Some mutations and deletions changes in RNA secondary structures such as SL(stem-loop) structures, ML(Multiloop) structures and IL(Interior loop) structures in 5 'UTR and 3' UTR were taken by use of mutagenesis PCR methods. The influence of transcription and regulation on above changes was confirmed by the test on N-mRNA and EGFP-mRNA. In animal experiments, Balb/c mouse were immunized a series of mutant replicon vector. The immunogenicity was tested by N-ELISA, EGFP-ELISA and T cell proliferation assay methods. Through the statistical analysis of the experimental data, the derivation of non-coding regions between PRRSV transcription and regulation mechanism of action and different transcriptional regulation unit.

以本实验室分离、鉴定、保存的PRRSV DY株作为亲本毒株，扩增该毒株的全长cDNA(GenBank: JN864948)。克隆斧头状核酶和丁型肝炎病毒核酶序列以及DY株的5′UTR和3′UTR、非结构蛋白基因、N蛋白基因以及报告基因EGFP构建复制子载体。利用突变PCR，对存在于5′UTR和3′UTR的多个茎环结构、多环结构以及内环结构进行突变、缺失，通过RT-PCR和荧光检测方法，检测报告基因EGFP和PRRSV N蛋白基因的mRNA的转录和表达情况，检测RNA二级结构中单独核苷酸或区域的改变或缺失对转录和调控的影响。以一系列突变的复制子载体免疫Balb/c小白鼠，采用N-ELISA、EGFP-ELISA和T细胞增殖实验方法，检测复制子载体所诱导的免疫应答情况。通过对上述实验数据统计分析，推导非编码区对PRRSV转录和调控作用机制以及不同转录调控单元之间的相互关系。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。正链RNA病毒的反向遗传操作系统在病毒复制、致病机制研究，抗病毒药物筛选和新型疫苗、导向载体制备等方面是一个极其有用的工具。本研究以本实验室分离、鉴定、保存的 PRRSV DY 株作为亲本毒株，构建复制子载体。对存在于 5′UTR 和 3′UTR 的多个茎环结构、多环结构以及内环结构进行突变、缺失，检测 RNA 二级结构中单独核苷酸或区域的改变或缺失对转录和调控的影响。最后以一系列突变的复制子载体免疫 Balb/c 小白鼠，采用Nsp7 ELISA检测复制子载体所诱导的免疫应答情况。. 实验结果表明，构建的PRRSV DY株复制载体转染后12 h即可观察到绿色荧光，荧光定量分析表明其蛋白表达在72 h达到最高峰，其后逐渐减弱。利用该复制子载体，本研究共计缺失了10个5′UTR和 3′UTR的茎环结构，将改造后的复制子载体分别转染BHK-21细胞株，利用PRRSV N-荧光定量PCR方法检测突变后对于复制子复制能力的影响。结果显示，缺失5′UTR的47-71 aa和7-42aa二个茎环结构，复制子复制能力显著降低，而敲除5′UTR的141-163 aa、82-104aa，3′UTR的132-172 aa、73-82 aa和148-153 aa复制子复制能力显著提高。另一方面，缺失5′UTR的133-138 aa，3′UTR的105-180 aa和110-120aa对复制子复制能力几乎没有影响。小鼠免疫实验结果与荧光定量检测结果相符，缺失5′UTR的47-71 aa和7-42aa二个茎环结构的复制子诱导产生的ELISA抗体水平最低，敲除5′UTR的141-163 aa，3′UTR的135-172 aa、73-82 aa和148-153 aa诱导的ELISA抗体水平最高。综上所述，我们发现存在于PRRSV的5′UTR和 3′UTR的二级结构对PRRSV的复制和转录具有重要的影响。存在于5′UTR的141-163 aa，存在于3′UTR的132-172 aa、73-82 aa和148-153 aa四个二级结构对于PRRSV的稳定性以及复制和转录是必须的。