动脉炎病毒PRRSV和EAV编码的3C样蛋白酶切割NEMO的分子机制

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and equine arteritis virus (EAV) as important members of Arterivirus, their 3C-like proteases (3CLpro) play important roles in virus replication and immunoregulation. Previous studies have demonstrated that NEMO, an essential kinase in interferon signaling pathways, is cleaved at glutamic acid (E349) by PRRSV 3CLpro. However, we found that PRRSV 3CLpro cleaves NEMO at two other sites as well as E349, and EAV 3CLpro also cleaves NEMO at multiple sites. Interestingly, NEMO are cleaved at different sites by PRRSV and EAV 3CLpro. The molecular basis and biological effects of 3CLpro-mediated different NEMO cleavages remain elusive. Here, we propose to: (i) identify all PRRSV and EAV 3CLpro cleavage sites within NEMO; (ii) pinpoint the key amino acids in 3CLpro that are responsible for PRRSV and EAV 3CLpro-mediated NEMO cleavage by crystal complexes, virtual screening and molecular dynamic simulation; and (iii) investigate the biological significance of PRRSV and EAV 3CLpro-mediated NEMO cleavage in NEMO knockout cell lines. Completion of this project will provide novel insights into the pathogenesis and immunologic mechanism of Arterivirus.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和马动脉炎病毒（EAV）均为动脉炎病毒，它们编码的3C样蛋白酶（3CLpro）在病毒复制与免疫调控方面发挥重要作用。以前研究表明PRRSV 3CLpro通过切割干扰素通路中重要激酶NEMO的第349位谷氨酸拮抗干扰素产生，但我们最近研究发现，除了第349位谷氨酸外，PRRSV 3CLpro还切割NEMO的另外两个位点，而且EAV 3CLpro也切割NEMO的多个位点，但切割位点不尽相同，这种切割差异的分子基础和生物学意义尚不清楚。本项目拟进一步鉴定PRRSV和EAV 3CLpro切割NEMO的所有位点，借助复合物晶体解析、虚拟氨基酸突变和分子动力学模拟等方法，挖掘PRRSV和EAV 3CLpro参与切割NEMO的关键氨基酸，并通过NEMO基因敲除细胞系分析PRRSV和EAV 3CLpro切割NEMO的生物学意义，为阐明动脉炎病毒的致病和免疫机制奠定基础。

马动脉炎病毒（EAV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是动脉炎病毒科的两个成员，对全世界的养马业和养猪业构成了重大威胁。动脉炎病毒nsp4编码的3C样蛋白酶（3CLpro）在病毒复制和免疫逃逸中起着重要作用，使其成为抗病毒治疗的一个重要靶标。在本项目中，我们发现EAV 3CLpro能通过切割NF-κB必须调节蛋白（NEMO）来抑制病毒诱导的β干扰素（IFN-β）产生，并且能切割NEMO的四个P1位点，分别是第166，171和349位谷氨酸（E166、E171、E349）以及第205位谷氨酰胺（Q205）。此外，我们还发现，除了之前报道的切割NEMO的E349位点外，PRRSV 3CLpro还能切割NEMO的另外两个P1位点E166和E171。研究结果表明，虽然切割NEMO是EAV和PRRSV 3CLpro用来拮抗IFN反应的常见策略，但EAV 3CLpro采用更复杂的底物识别机制来切割NEMO。通过分析EAV和PRRSV 3CLpro切割产生的8个不同NEMO片段诱导IFN-β产生的能力，发现NEMO片段（1～349）比全长NEMO更有效地激活IFN-β转录，而所有其他NEMO切割产物都丧失了诱导IFN-β产生的能力。因此，仅在E349处切割NEMO可能不足以完全抑制IFN反应。随后的同源建模和生物学实验表明，EAV和PRRSV 3CLpro形成了推定的S1口袋，并与底物存在相互作用。具体而言，PRRSV 3CLpro T113、C115、G116、S118、H133、S136和K138组成S1口袋中的重要氨基酸残基，并识别P1位点的谷氨酸（P1-E）。然而，EAV 3CLpro却利用T115、S117、G118、S120、H134和S137识别P1-E和P1-Q。突变体实验表明EAV 3CLpro的突变体(G118A、H134A和S137A)显著丧失了对P1-Q (Q205)的切割活性，但PRRSV 3CLpro的K138T突变体却获得了这种切割活性。总的来说，本研究发现EAV和PRRSV 3CLpro能切割NEMO的多个位点，这种策略能够抑制天然免疫反应从而促进病毒生存。此外，EAV和PRRSV 3CLpro底物特异性的表征将为研究动脉炎病毒3C样蛋白酶的底物识别特异性机制和开发抗动脉炎病毒药物提供有益信息。