硫酸类肝素、纤维素原、LPS与TLR4信号转导通路形成“二次打击”在严重烧伤后G-杆菌脓毒症中的作用研究

Toll样受体4（TLR4）信号转导通路与严重烧伤后G-杆菌感染及脓毒症密切相关。但针对LPS-TLR4通路的干预性治疗并未取得满意效果，说明外源性LPS可能并非TLR4通路的唯一激活途径。最近研究表明，硫酸类肝素、纤维素原作为TLR4的内源性激活物，可发挥与LPS类似的生物学效应。鉴于严重烧伤后先有硫酸类肝素、纤维素原的表达增高，后有LPS的大量释放，我们推测在严重烧伤后脓毒症的发病过程中可能存在"二次打击"：即早期的内源性硫酸类肝素、纤维素原诱导激活TLR4信号通路为"一次打击"，随后感染期外源性LPS激活TLR4信号通路作为"二次打击"，两者叠加或累积，在G-杆菌脓毒症发生中起到关键性推动作用。我们以血管内皮细胞为靶细胞，采用免疫组化、流式细胞术及共聚焦显微镜示踪等技术，通过离体及在体实验研究严重烧伤后脓毒症的发病机制，为危重病患救治的新思路提供有效理论依据。

严重烧伤早期往往发生缺血再灌注损伤，并继而成为多脏器损害和严重感染的基础之一，其中以肺损伤最为重要，研究发现局部炎性状态的改变可能在其中起着至关重要的作用。对缺血再灌注损伤的研究显示，Toll样受体4（TLR4）能够识别机体自身产生的内源性激活物，诱导机体天然免疫应答，但是目前相关研究尚不能完全解释TLR4和局部炎性状态改变参与该过程的机制。本研究利用野生型和TLR4基因敲除的小鼠，构建肠缺血再灌注导致急性肺损伤的动物模型，分析TLR4在缺血再灌注损伤及炎症过程中的作用；并通过体内、外实验，对TLR4和局部炎性状态改变在急性肺损伤中的作用机制进行探讨。结果显示，TLR4信号的缺失能够显著的降低肺组织水肿、肺泡充血和白细胞浸润的程度，抑制肠缺血再灌注损伤诱发的肺泡内皮细胞凋亡和肺血管通透性升高，下调肠缺血再灌注损伤诱发的TNF-α、IL-6、MCP-1、MIP-2等肺炎性细胞因子的水平以及肺内髓过氧化物酶（MPO）活性的升高，提示了TLR4信号的缺失对肠缺血再灌注诱发的肺损伤具有重要的保护性作用，且该作用可能通过改变肺炎性细胞因子的表达，进而影响p38、NF-κB、AP-1等下游信号通路得以实现。进一步通过活化素受体样激酶5（ALK5）的抑制剂（SB431542）抑制其活性，阻断TGF-β/Smad通路，能够导致肺内TNF-α、IL-1β等肺炎性细胞因子的释放、金属蛋白酶9（MMP-9）表达水平的升高以及细菌脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤。与此同时，MMP-9表达水平和活性的升高能诱导肺血管通透性的增加、细胞外基质的降解和正常肺组织结构的破坏，直接或间接的促进肺部炎症反应性，导致急性肺损伤的加重。我们的研究进一步揭示了TLR4在缺血再灌注损伤过程中的作用以及TLR4、肺炎性细胞因子及其下游信号通路参与缺血再灌注导致肺损伤过程的分子机制，为烧伤等危重病患的临床救治新思路的开辟提供有效理论依据。上述结果已总结形成SCI论文两篇，一篇于2012年发表在《Journal of Surgical Research》杂志上，另一篇已被《European Review for Medical and Pharmacological Sciences》接收。本课题的成果申请国家专利一项，研究开展期间培养研究生2名。