乙酰化修饰对板栗疫病菌毒力的调控机制研究

Hypovirus/Cryphonectria parasitica (Cp) system is regarded as an excellent experimental system to dissect the virulence regulation mechanism and virus-host interaction, since infection by a hypovirus can profoundly reduce the virulence and result in persistent changes in multiple traits of this pathogenic fungus. Lysine acetylation is a ubiquitous, reversible and highly regulated protein post-translational modification. It was involved in many biological processes, including transcription, central metabolism, protein synthesis and degradation, cell cycle and stress response,etc. To date, little is known about the role of acetylation in pathogenic fungus. In this study, the acetylome from the EP155 and EP713 will be identified and compared using immune-affinity purification, LC-MS/MS and label-free based quantitative proteomics. The differentially expressed acetylated proteins will be to study the relationship between acetylation and the protein function. The role of key acetylated protein will be investigated physiologically and pathogenetically. The results obtained will help to unvail the mechanism of virulence regulation in Cp, and lay the foundation for the deep research of fungal pathogenesis and potential biological control.

低毒病毒侵染可导致板栗疫病菌（Cp）表型发生改变并显著降低真菌的毒力，因而该系统被视为研究真菌致病机制和病毒-宿主相互作用的一个优秀模型。赖氨酸乙酰化修饰是一种普遍存在的、可逆且高度调控的蛋白质翻译后修饰方式，参与调控基因转录、新陈代谢、蛋白合成与降解、细胞周期及应激反应等多种生命活动。然而，蛋白质乙酰化在病原真菌中的研究却很少。本课题拟以Cp野生强毒株（EP155）和低毒病毒侵染的弱毒株（EP713）为实验材料，应用基于抗体免疫富集、质谱鉴定和Label-Free技术的定量蛋白组学研究对EP155和EP713进行蛋白质乙酰化修饰鉴定和定量分析，获得板栗疫病菌乙酰化蛋白图谱，筛选差异乙酰化蛋白，研究乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用，明确关键乙酰化蛋白在真菌毒力和重要生理形状表达上的作用，从而进一步揭示Cp毒力调节的机制，为深入研究植物病原真菌的致病机理和潜在的生物防控方法奠定基础。

低毒病毒侵染可导致板栗疫病菌表型发生改变并显著降低真菌的毒力，该系统被视为解析病原真菌致病机理的一个优秀模型。蛋白质赖氨酸乙酰化修饰是一种普遍存在的、可逆的翻译后修饰方式，它广泛参与调节基因转录、新陈代谢、蛋白合成与降解、细胞周期及应激反应等多种生命活动。目前，蛋白质的赖氨酸乙酰化修饰在致病真菌中的调节机制和功能尚不明确。本研究以板栗疫病菌野生强毒株EP155和低毒病毒侵染的弱毒株EP713为实验材料，应用基于抗体免疫富集、高分辨率质谱鉴定和Label-Free技术的定量蛋白组学技术，获得了板栗疫病菌乙酰化蛋白图谱。结果显示，在板栗疫病中共鉴定到了329个乙酰化蛋白和660个乙酰化位点。其中，41个乙酰化蛋白，83个乙酰化位点仅在EP155中被鉴定到；26个乙酰化蛋白，90个乙酰化位点仅在EP713中被鉴定到。与EP155相比，157个蛋白的乙酰化水平在EP713中显著上调， 125个下调。生物信息学分析表明，板栗疫病菌赖氨酸乙酰化蛋白参与糖酵解，大分子生物合成和柠檬酸循环等细胞过程，部分乙酰化蛋白涉及到对真菌致病力的调控。. 利用IP及Western blot技术对板栗疫病菌柠檬酸合成酶（CpCs）的差异乙酰化进行了验证。通过原核表达、蛋白纯化及定点突变检测了CpCs的55位赖氨酸的乙酰化对于酶活性的影响，发现将K55突变为R后蛋白的乙酰化水平下降，酶活上升。为了进一步研究CpCs的乙酰化在板栗疫病菌生长及致病中的作用，利用同源重组双交换的方法成功构建了缺失突变株∆cpcs，并对其生物学表型进行分析，结果显示与野生型菌株相比，板栗疫病菌cpcs基因敲除株菌落生长速率变慢，菌丝形态正常，色素变少，气生菌丝减少，产孢能力丧失，致病力显著降低。分别构建了∆cpcs的野生型回补株和点突变（K55R）的回补株，结果显示∆cpcs-com转化株的色素、产孢能力及致病力等都恢复到野生型水平。但∆cpcs-com-K55R的产孢能力和致病力均显著低于野生型。此结果表明CpCs的乙酰化位点对于该蛋白在真菌中的功能非常重要。. 本结果为揭示乙酰化修饰在病原真菌中的调节机制提供了新的认识。