MicroRNA对板栗疫病菌毒力的调控机制研究

Hypovirus/Cryphonectria parasitica (Cp) system is regarded as an excellent experimental system to dissect the virulence regulation mechanism, since infection by a hypovirus can profoundly reduce the virulence and result in persistent changes in multiple traits of this pathogenic fungus. MicroRNA (miRNA) are a class of endogenous non-coding RNAs that play an important role in many biological processes，such as growth，development，metabolism and diseases. To date, little is known about the role of miRNA in pathogenic fungus. In this study, the miRNA from the EP155 and EP713 will be identified and compared with Solexa depth sequencing analysis. The differentially expressed miRNA will be to study the relationship between miRNA and the virulence by up-regulating/down-regulating its expression. To elucidate the regulatory mechanism of miRNA in the fungus virulence, the targets of miRNA will be identified and the role of target protein in virulence will be investigated.The role of key miRNA will be investigated physiologically and pathogenetically. The results obtained will help to unvail the mechanism of virulence regulation in Cp.

低毒病毒侵染可导致板栗疫病菌（Cp）表型发生改变并显著降低真菌的毒力，因而该系统被视为解析病原真菌致病机理的一个优秀模型。MicroRNA(miRNA)是进化保守的非编码小分子RNA，与生物体的生长、发育、代谢及疾病的发生密切相关。然而，miRNA在病原真菌中的研究却很少。本课题拟以Cp野生强毒菌株和受病毒侵染的弱毒菌株为实验材料，通过Solexa深度测序，获得板栗疫病菌的miRNA图谱，寻找差异表达的miRNA。对差异表达的miRNA进行过表达/抑制表达，研究其与真菌毒力的关系，进一步鉴定其作用靶标，并研究靶标基因对毒力的作用，明确关键miRNA在真菌毒力和重要生理性状表达上的作用，从而进一步揭示Cp毒力调节的机制。

为了揭示板栗疫病菌中miRNA的功能，本研究以板栗疫病菌野生型强毒菌株EP155和受低毒病毒侵染的弱毒菌株EP713为材料，通过Solexa测序获得了两个菌株的miRNA表达图谱。EP155中有95个已知的miRNA，EP713中有88个已知的miRNA，两样品中有143个差异显著的已知miRNA；EP155中有241个新的miRNA，EP713中有110个新的miRNA，两样品之间有98个差异显著的新的miRNA。通过对差异miRNA靶基因GO分类以及KEGG分析，发现靶基因主要参与生物体的代谢过程和催化作用，主要富集在磷酸戊糖通路、细胞循环以及致病机理通路。利用qRT-PCR技术对测序结果进行验证，结果显示高通量测序结果可靠。. 为了研究在EP713中表达量下调的milRNAs的功能，我们成功构建了5个milRNAs 的缺失突变株（Δpre-milRNA16、Δpre-milRNA44、Δpre-milRNA57、Δpre-milRNA70、Δpre-milRNA80）及其互补转化株。与野生型菌株EP155相比，5个milRNAs缺失突变株的表型及生长速率均无明显改变，但产孢量和致病力均明显下降；显微观察结果显示除Δpre-milRNA16 外其余4个敲除株的菌丝形态都发生了改变。. 为了研究在EP713中表达量上调的milRNAs的功能，我们成功构建了5个milRNAs的过量表达转化株（OE-pre-milRNA251、OE-pre-milRNA272、OE-pre-milRNA313、OE-pre-milRNA325、OE-pre-milRNA334）。与野生型菌株EP155相比，5个过表达株的表型及菌丝形态都发生了改变，而且产孢量和致病力也明显下降，生长速率除OE-pre-milRNA313外均明显下降。. 本研究发现板栗疫病菌中10个关键milRNAs在调控真菌生长、菌丝形态、产孢及致病力方面具有重要作用，为进一步揭示植物病原真菌的致病机理，研究milRNAs在其他病原真菌中的调节作用奠定了基础。